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May 17, 2024

Die Verbindung immunmodulatorischer, angiogener und osteogener Fähigkeiten in einem piezoelektrischen Hydrogel-Gewebe-Engineering-Gerüst für die Militärmedizin

Military Medical Research Band 10, Artikelnummer: 35 (2023) Diesen Artikel zitieren 264 Zugriffe auf Metrikdetails Die meisten Knochenverletzungen bei Basistruppen werden durch Training oder Unfälle verursacht

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Die meisten Knochenverletzungen bei Basistruppen werden durch Trainings- oder Unfallverletzungen verursacht. Um präventive Maßnahmen zur Reduzierung aller Arten von Traumata zu etablieren und die Kampfkraft der Basistruppen zu verbessern, ist es unerlässlich, neue Strategien und Gerüste zur Förderung der Knochenregeneration zu entwickeln.

In dieser Studie wurde ein poröses piezoelektrisches Hydrogel-Knochengerüst hergestellt, indem Polydopamin (PDA)-modifizierte keramische Hydroxylapatit- (PDA-Hydroxylapatit, PHA) und PDA-modifizierte Bariumtitanat- (PDA-BaTiO3, PBT)-Nanopartikel in ein Chitosan/Gelatine (Cs /Gel-Matrix. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Cs/Gel/PHA-Gerüsts mit 0–10 Gew.-% PBT wurden analysiert. Zell- und Tierversuche wurden durchgeführt, um die immunmodulatorischen, angiogenen und osteogenen Fähigkeiten des piezoelektrischen Hydrogelgerüsts in vitro und in vivo zu charakterisieren.

Der Einbau von BaTiO3 in das Gerüst verbesserte seine mechanischen Eigenschaften und erhöhte die selbst erzeugte Elektrizität. Aufgrund ihrer endogenen piezoelektrischen Stimulation und bioaktiven Bestandteile zeigten die so hergestellten Cs/Gel/PHA/PBT-Hydrogele Zytokompatibilität sowie immunmodulatorische, angiogene und osteogene Fähigkeiten; Sie induzierten nicht nur wirksam die Polarisation von Makrophagen zum M2-Phänotyp, sondern förderten auch die Migration, Röhrenbildung und angiogene Differenzierung menschlicher Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVECs) und erleichterten die Migration, Osteodifferenzierung und Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM) von MC3T3- E1-Zellen. Die In-vivo-Bewertungen zeigten, dass diese piezoelektrischen Hydrogele mit ihren vielseitigen Fähigkeiten die Knochenneubildung in einem Rattenmodell mit großen Schädelverletzungen erheblich erleichterten. Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus kann teilweise auf die Immunmodulation der Cs/Gel/PHA/PBT-Hydrogele zurückgeführt werden, wie durch Transkriptom-Sequenzierungsanalyse gezeigt, und die PI3K/Akt-Signalachse spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Makrophagen-M2-Polarisierung.

Die hier entwickelten piezoelektrischen Cs/Gel/PHA/PBT-Hydrogele mit günstigen Immunmodulations-, Angiogenese- und Osteogenesefunktionen können als Ersatz bei Periostverletzungen eingesetzt werden und bieten so die neuartige Strategie der Anwendung piezoelektrischer Stimulation im Knochengewebe-Engineering zur Verbesserung der Kampfeffektivität in Basistruppen.

Neben Krankheiten sind Trainingsverletzungen und Unfallverletzungen wichtige Ursachen für den Truppenrückgang außerhalb des Kampfeinsatzes in Basistruppen unter Nichtkriegsbedingungen. Von allen Verletzungen waren 70,3 % Trainingsverletzungen und 29,7 % Nicht-Trainingsverletzungen. Insgesamt 66,6 % der Knochenverletzungen wurden durch solches Training und Unfallverletzungen verursacht [1, 2]. Um vorbeugende Maßnahmen zur Reduzierung aller Arten von Traumata zu etablieren und die Kampfeffektivität von Basistruppen zu verbessern, ist es unerlässlich, neue Medikamente und Gerüste zu entwickeln, um die Reparatur von Knochenverletzungen zu fördern [3, 4]. Die Heilung von Knochenverletzungen ist aufgrund des Risikos einer unkontrollierten und anhaltenden Entzündung, einer gestörten Sauerstoffversorgung aufgrund blockierter Osteogenese/Angiogenese und einer Überlastung mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) eine große Herausforderung [5]. Die Verwendung von Gerüstmaterial für das Bone Tissue Engineering, das eine Mikroumgebung für die Knochenregeneration bereitstellen kann, ist eine wirksame alternative Strategie zur Unterstützung der Knochenregeneration [6]. Gegenwärtig ähnelt die Wirkung vieler Gerüste für das Knochengewebe-Engineering der autologen Knochentransplantation [7], und viele neue Methoden, wie z. B. die elektrische Stimulation, wurden im Bereich des refraktären Knochengewebe-Engineerings eingeführt [8]. Die Optimierung des kombinierten Einsatzes dieser Technologien bleibt jedoch eine Herausforderung.

Viele Berichte haben gezeigt, dass die elektrische Mikroumgebung eine wichtige Rolle bei der Reparatur von Knochenverletzungen spielen kann [9, 10]. Darüber hinaus kann die elektrische Signalübertragung im Körper das Makrophagenverhalten regulieren, beispielsweise die Migration, die phagozytische Aktivität und die Zytokinproduktion [11]. Zusätzlich zum Einbau häufig verwendeter bioaktiver Makromoleküle und Nanomoleküle hat die aufkeimende Forschung herausgefunden, dass mehrere physiologische Signale, darunter Mechanik, Elektrizität und Magnetismus, neue Perspektiven für die Knochenregeneration darstellen, indem sie das knochenbezogene Zellverhalten und Zellreifungsereignisse beeinflussen [12] . Beispielsweise ist das Knochengewebe selbst piezoelektrisch und reagiert auf mechanische Aktivitäten des Körpers selbst, was den Stoffwechsel und die Proliferation von Osteozyten regulieren kann [13]. Piezoelektrische Biomaterialien wie Poly-L-Milchsäure, Kollagen, Seide und Kalium-Natrium-Niobat können die physiologische elektrische Mikroumgebung erzeugen und eine wichtige Rolle bei der Steigerung der Stoffwechselaktivitäten spielen [14, 15]. Wichtig ist, dass die klinische Elektrostimulationstherapie seit der Entdeckung der bioelektrischen Eigenschaften von Knochen vor 70 Jahren gezeigt hat, dass sie die Knochenheilung und Wirbelsäulenfusion erleichtern kann [16]. Kürzlich wurde gezeigt, dass die In-vitro-Elektrostimulation positive Auswirkungen auf die Proliferation, Migration und Differenzierung knochenbildender Zellen (mesenchymale Knochenstammzellen, Osteoprogenitoren, Osteoblasten und Endothelzellen) hat [17]. Zu den möglichen Mechanismen, durch die die Elektrostimulation die Osteogenese fördert, gehören die Hochregulierung osteoblastenbedingter intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen, die primäre Öffnung spannungsgesteuerter Ca2+-Kanäle und die beschleunigte Osteogenese durch die Hochregulierung von Calmodulin-Signalwegen [18].

Darüber hinaus steht die Bildung von neuem Knochen nach Knochendefekten in engem Zusammenhang mit der Vaskularisierung, und neue Blutgefäße können an einer Reihe physiologischer und pathologischer Prozesse der Knochenregeneration beteiligt sein und somit als wichtige Bindeglieder bei der Knochenregeneration nach Knochenverlust fungieren. Übermäßiger oxidativer Stress verringert die Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), wodurch die Angiogenesefunktion der Knochendefektstelle erheblich beeinträchtigt wird. Studien haben gezeigt, dass Elektrostimulation die Gefäßerweiterung fördern, die Gefäßpermeabilität erhöhen und die lokale Gewebedurchblutung erhöhen kann [19,20,21]. Die elektrische Stimulation kann auch vaskuläre Endothelzellen in der Nähe der Frakturnekrose dazu anregen, sich zu neovaskularisieren und in das ischämische Ende hineinzuwachsen, wodurch die Blutversorgung des verletzten Gewebes sichergestellt wird. Die Neovaskularisation steht in engem Zusammenhang mit der VEGF-Expression; Allerdings fördern nicht alle Arten der elektrischen Stimulation die VEGF-Expression [22]. Beispielsweise haben Srirussamee et al. [23] zeigten, dass Gleichstromstimulation die Expression von VEGF in Präosteoblasten nicht förderte. Kim et al. [24] bestätigten, dass die Stimulation mit Wechselstrom (AC) die VEGF-Expression deutlich hochregulieren könnte, wenn sie durch RT-PCR- und ELISA-Experimente gemessen wurde. In unserer vorherigen Forschung haben wir piezoelektrische Filme durch die Kombination piezoelektrischer Nanomaterialien konstruiert, die durch mechanische Kräfte angetriebenen Wechselstrom erzeugen könnten [25, 26]. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die AC-Stimulation die Expression von VEGF an Stellen mit Gewebedefekten wirksam fördern und so die Bildung neuer Blutgefäße fördern kann [19]. Dobashi et al. [27] entwickelten piezoionische Hydrogele, die Druckreize in Ströme für Neuromodulationsanwendungen umwandeln konnten. Vor diesem Hintergrund besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung eines Gerüstmaterials für das Knochengewebe-Engineering, das sowohl die Immunmikroumgebung regulieren als auch unter mechanischer Einwirkung Wechselstrom erzeugen kann.

In dieser Studie wurde ein piezoelektrisches Hydrogel-Knochengerüst hergestellt, indem Polydopamin (PDA)-modifizierte Bariumtitanat-Nanopartikel (PDA-BaTiO3, PBT) und Polydopamin-modifizierte keramische Hydroxylapatit-Nanopartikel (PDA-HA, PHA) in Chitosan/Gelatine [Cs/ Gel (CG)] Hydrogele. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften wurden getestet, um zu bestätigen, dass die Änderung der Eigenschaften des piezoelektrischen Hydrogels auf die Einführung von BaTiO3 zurückzuführen ist. Da die piezoelektrischen Hydrogele mit Cs/Gel/PDA-modifiziertem HA/PDA-modifiziertem BaTiO3 (CG/PHA/PBT) für eine in situ stabilisierte Elektrostimulation sorgen konnten, wurde der Nutzen der piezoelektrischen Hydrogele mit CG/PHA/PBT für die Reparatur großer Knochen beurteilt um die In-vivo-Fähigkeit zur Heilungsförderung, die immunmodulatorische Funktion sowie die angiogene und osteogene Aktivität zu untersuchen. Schließlich wurde eine Analyse der RNA-Transkriptomik und des Inhibitionsexperiments durchgeführt, um den Schlüsselsignalweg zur Regulierung der Knochenregeneration durch piezoelektrische Hydrogele zu verifizieren.

Cs, Gel und Dopaminhydrochlorid wurden von Sigma-Aldrich Co., Ltd. (9012-76-4, 9000-70-8, H8502; St. Louis, MO, USA) gekauft. BaTiO3-Nanopartikel wurden von Alfa Aesar (12047-27-7; Wardhill, MA, USA) bereitgestellt. Für Zellkulturexperimente werden fötales Rinderserum, alpha-modifiziertes Eagle-Medium (α-MEM), Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Penicillin/Streptomycin verwendet (P/S) wurden von Gibco Life Technologies Co. (10100147, 12571063, 11965092, 70011044, 17892, 15070063; Grand Island, USA) bezogen. Das Zellzählkit-8 (CCK-8) wurde von Dojindo Laboratories (CK04; Kumamoto, Japan) erworben. Das Färbekit für lebende/tote Zellen wurde von BestBio Biotechnologies (C2015M; Shanghai, China) bezogen. Zur Zellfärbung wurden Triton X-100 (9036-19-5; Sigma-Aldrich), DAPI (28718-90-3; Sigma-Aldrich) und TRITC-markiertes Phalloidin (A34055; Invitrogen, USA) verwendet. Das Hoechst 33342-Färbemittel, das BeyoClick™ EdU-555-Bildgebungskit, das Annexin V-FITC-Apoptose-Nachweiskit, das TRIzol-RNA-Extraktionskit, der Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Lysepuffer, 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblautetrazolium (BCIP/NBT), das Farbentwicklungskit für alkalische Phosphatase (ALP) und das Proteintestkit für Bicinchoninsäure (BCA) wurden von Beyotime Biotechnology Co., Ltd. bereitgestellt (C1022, C0075S, C1062S, R0016, P0013B, C3206, P0321M, P0009). ; Jiangsu, China). Die Färbelösung Alizarinrot S (ARS) wurde von Servicebio Co., Ltd. (G1038; Wuhan, China) erworben. Alle Chemikalien wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Das in allen Experimenten verwendete Wasser wurde mit einem Milli-Q-Zyklusreinigungssystem (Millipore, USA) gereinigt.

Die Herstellung von PHA und PBT ist in Abb. 1a dargestellt. 1 g HA- oder BaTiO3-Nanopartikel wurden in einer PDA-Lösung dispergiert und 12 Stunden lang bei 37 °C gehalten. Die Nanopartikel wurden durch Gradientenzentrifugation gesammelt. Zur Herstellung der piezoelektrischen Hydrogele wurde Cs in 1 % Acetum [2 % (Gew./Vol.)] gelöst und das Gel wurde vollständig in entionisiertem Wasser [2 % (Gew./Vol.)] gelöst. Die Cs- und Gellösungen wurden im Verhältnis 1:1 gemischt, um eine CG-Lösung zu bilden. Das PHA-Pulver wurde der CG-Lösung in einer Menge von 10 % des Gesamtgewichts des CG zugesetzt, um eine CG/PHA-Suspension zu erhalten. Dann wurde das PBT-Pulver in Anteilen von 0, 5 und 10 Gew.-% des Gesamtgewichts zu der obigen Lösung gegeben. Einhundert Mikroliter Genipin-Lösung [2 % (Gew./Vol.)] wurden nacheinander zu 10-ml-Aliquoten der CG/PHA/PBT-Lösung gegeben, 10 Minuten lang gerührt, bis sie vermischt waren, und dann zur Gelbildung in Platten gegossen. In den folgenden Abschnitten werden reine CG-Hydrogele als CG-Gruppe, Nanokomposit-CG-Hydrogele mit PHA-Funktionalisierung als CG/PHA-Gruppe und Nanokomposit-CG-Hydrogele mit 5 Gew.-% und 10 Gew.-% PBT-Funktionalisierung als CG/PHA-Gruppe bezeichnet. PHA/5 % PBT- bzw. CG/PHA/10 % PBT-Gruppen.

Schematische Darstellung der Designstrategie der piezoelektrischen CG/PHA/PBT-Hydrogele und des Knochenregenerationsmechanismus. a Der Herstellungsprozess der piezoelektrischen CG/PHA/PBT-Hydrogele. b Die Anwendung und der potenzielle biologische Mechanismus der piezoelektrischen Hydrogele für eine schnelle Knochenregeneration. c Schematische Darstellung des möglichen autarken Mechanismus der piezoelektrischen CG/PHA/PBT-Hydrogele. Die Dipole in den BT-Nanopartikeln sind in den piezoelektrischen Hydrogelen in die gleiche Richtung ausgerichtet. Die elektrische Polarisation wird in Richtung der ausgerichteten Dipole dargestellt und kann ein piezoelektrisches Potenzial in den piezoelektrischen BT-Nanopartikeln erzeugen. Ohne äußere Reize herrscht im Hydrogel ein positives und negatives Ladungsgleichgewicht. Sobald ein Druckreiz auf die piezoelektrischen Hydrogele ausgeübt wird, fließen die Elektronen in den Hydrogelen aus dem Hydrogel. Sobald der Druck verschwindet, fließen die angesammelten freien Ladungen zurück in die piezoelektrischen Hydrogele. BT-Bariumtitanat, HA-Hydroxylapatit, Cs-Chitosan, Gelgelatine, PHA-Polydopamin-beschichtetes Hydroxylapatit, PBT-Polydopamin-beschichtetes Bariumtitanat, e− Elektron, R-Resistenz, M0 mφ unpolarisierter Makrophage, M1 mφ Typ 1 Makrophage, M2 mφ Typ 2 Makrophage, IL-6-Interleukin-6, IL-4-Interleukin-4, TNF-α-Tumornekrosefaktor-α, iNOS-induzierbare Stickoxidsynthase, CD86-Differenzierungscluster 86-Protein, Arg1-Arginase, BMSC-Knochenmarksstromazelle, menschliche Nabelschnurvene HUVEC Endothelzelle

Nach dem Gefriertrocknen der piezoelektrischen Hydrogele wurde die Topographie der piezoelektrischen Hydrogele mit einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (FE-SEM; Zeiss, Sigma, Deutschland) charakterisiert und die Ca-, P-, Ba- und Ti-Elementverteilung in den piezoelektrischen Hydrogelen bestimmt gescannt mit dem energiedispersiven Spektrometer (UltimMax 40, Oxford, UK). Die Funktionsgruppenänderungen in den piezoelektrischen Hydrogelen wurden durch Röntgenbeugung (XRD; Rigaku, Japan) und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR; TNZ1-5700, Nicolet, USA) getestet. Der Elastizitätsmodul von piezoelektrischen Hydrogelen wurde mit einem Rheometer (Kinexus, Malvern) ermittelt. Die Ausgangsspannungen der piezoelektrischen Hydrogele wurden mit einem digitalen Speicheroszilloskop (RTM3000, Rohde & Schwarz, Deutschland) bestimmt.

Die RAW 264.7-Zellen (aus Mäusen stammende Makrophagenzelllinie) wurden vom Institut für Biochemie und Zellbiologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) (ab275474; Abcam, USA) bereitgestellt. Der CCK-8-Assay wurde durchgeführt, um die Zytotoxizität der piezoelektrischen Hydrogele zu bewerten. Die Extrakte aus den piezoelektrischen Hydrogelen wurden gemäß ISO1099312:2007 gewonnen. Als Kontrolle diente das Kulturmedium ohne die Extrakte. Nach 1, 2 und 3 Tagen Kultur wurde die CCK-8-Lösung in jede Vertiefung gegeben (20 μl pro Vertiefung) und die Zellen wurden weitere 4 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Außerdem wurde die Lebend-/Totfärbung durchgeführt, um die Lebensfähigkeit von RAW 264.7-Zellen auf verschiedenen piezoelektrischen Hydrogelen zu überprüfen. Die lebenden Zellen wurden mit Calcein-AM grün gefärbt und die toten Zellen wurden mit Propyliodid (PI) rot gefärbt. Die 3D-Kultur von Makrophagen (RAW 264.7-Zellen) mit den piezoelektrischen Hydrogelen wurde ähnlich wie die 2D-Kultur durchgeführt. Um 3D-Bilder zu erstellen, wurden die durch Z-Stacking erfassten Originaldaten mit der Leica-Schwarz/Blau-Software (Leica) verarbeitet. Alle diese Experimente zur Bewertung der Zellapoptose wurden an piezoelektrischen Hydrogelen durchgeführt.

Zunächst wurde Immunfluoreszenz verwendet, um die morphologischen Veränderungen in Makrophagen zu beobachten, die auf verschiedenen Proben kokultiviert wurden. Kurz gesagt, nach zweitägiger Kokultivierung wurden die Proben mit F-Actin und F4/80 angefärbt und mit einem konfokalen Mikroskop fotografiert. Als nächstes wurden für die phänotypische Polarisation Oberflächenmarker von M1-Makrophagen (CD86) und M2-Makrophagen (CD206) mithilfe der Durchflusszytometrie wie zuvor beschrieben nachgewiesen (28). RAW 264.7-Zellen wurden zunächst 24 Stunden lang mit Lipopolysaccharid (LPS) behandelt, um die entzündliche Mikroumgebung während der Knochenheilung einfach in vitro zu stimulieren. Die geernteten Zellen wurden dann auf jede Probe in einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 3 × 104 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach 2-tägiger Inkubation wurden die Zellen durch Trypsinisierung gesammelt und dann 20 Minuten lang mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Nach zweimaligem Spülen mit PBS wurden Allophycocyanin (APC)-konjugiertes CD86 (105011, BioLegend, China) und FITC-konjugiertes CD206 (141703, BioLegend, China) 30 Minuten lang zur Oberflächenantigenfärbung verwendet. Die behandelten Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie (FC500, USA) unter Verwendung der FlowJo-Software (Tree Star Inc., USA) analysiert. Die Polarisation von Makrophagen wurde durch Immunfluoreszenzfärbung und Western-Blot-Assays analysiert. Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS; ab210823, Abcam, UK) und CD206-Antikörper (M2-Marker, PA5-101657, Invitrogen, USA) verwendet, um die Polarisation von Makrophagen nachzuweisen. Die primären Antikörper gegen iNOS (GTX130246, Genetex, USA), CD206 (24595S, Cell Signaling, USA) und GAPDH (ab8245, Abcam, UK) wurden für den Western-Blot-Assay inkubiert.

Die entzündungshemmende Wirksamkeit des piezoelektrischen Hydrogels wurde durch RT-qPCR weiter analysiert. Kurz gesagt, nach zweitägiger Kokultivierung wurden die vollständige RNA-Isolierung, die Synthese komplementärer DNA (cDNA) und RT-qPCR wie oben beschrieben durchgeführt. Die Genexpressionsniveaus wurden auf die des endogenen Housekeeping-Gens GAPDH normalisiert. Die Primersequenzen jedes Gens sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt.

Nachdem die Makrophagen zwei Tage lang kokultiviert worden waren, wurde der Überstand jeder Gruppe zur weiteren Untersuchung auf der Grundlage zuvor berichteter Protokolle gesammelt (29). Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 8000 U/min und Filtration durch einen 0,22-μm-Filter wurden die sterilen Überstände sorgfältig gesammelt und bei 4 °C gelagert. Darüber hinaus wurden die Konzentrationen von BMP-2, TGF-β1, VEGF und bFGF, die von Zellen im gesammelten Überstand sezerniert wurden, mit entsprechenden ELISA-Kits gemessen. Alle ELISA-Messungen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

RNA-seq wurde durchgeführt, um die Genexpressionsprofile von Makrophagen zu untersuchen, die auf verschiedenen Hydrogelen kultiviert wurden. Kurz gesagt, RAW 264.7-Makrophagen (1 × 106 Zellen/ml) wurden 2 Tage lang auf verschiedenen Hydrogelproben in Platten mit 24 Vertiefungen co-kultiviert. Anschließend wurde die Gesamt-RNA aus den Makrophagen jeder Gruppe unter Verwendung von TRIzol-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers gesammelt. RNA-Proben wurden vor der Sequenzierung bei –80 °C gelagert. Abschließend wurde die RNA-Sequenzierung mit BMK Cloud (https://www.biocloud.net/) durchgeführt. Die Expression mehrerer ausgewählter Gene wurde mithilfe einer Heatmap untersucht und durch eine Pathway-Analyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ausgewertet.

Um die Signalwege zu verifizieren, die möglicherweise am Beitrag der piezoelektrischen Hydrogele zur M2-Polarisation beteiligt sind, wurde ein Inhibitor (BEZ235, 0–200 nmol/L, Selleck, USA) von PI3K in vollständiges Zellkulturmedium gegeben, um RAW 264.7-Zellen auf Piezoelektrika zu kultivieren Hydrogele. LPS (200 ng/ml) wurde zusammen mit Makrophagen als Negativkontrolle kultiviert. Als Positivkontrolle wurde auch Interleukin-4 (IL-4, 20 ng/ml) gemeinsam mit Makrophagen kultiviert. Nach 48 Stunden wurden die RAW 264.7-Zellen für einen Immunfluoreszenz-Färbetest zum Nachweis ihrer Polarisation geerntet.

Die durch die piezoelektrischen Hydrogele geförderte Migrationsaktivität menschlicher Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC; CRL-1730, ATCC, USA) wurde durch Transwell- und In-vitro-Kratzwundentests bestimmt [30]. Für den Transwell-Kammertest wurden die HUVEC-Zellen in der oberen Kammer ausgesät. Das Makrophagenmedium wurde in die untere Kammer gegeben. Die migrierten Zellen auf der Unterseite wurden zur Beobachtung mit 0,1 %iger Kristallviolettlösung angefärbt. Beim Kratzwundentest wurde ein gerader Kratzer erzeugt, als die HUVECs eine Konfluenz von 90 % erreichten. Das Makrophagenmedium wurde zur Stimulierung der HUVEC-Migration hinzugefügt. Die HUVECs-Zellen wurden fixiert und dann zur Migrationsbeobachtung mit Kristallviolettlösung angefärbt.

Der Gefäßbildungstest wurde mit HUVECs unter verschiedenen Makrophagenmedien gemessen, um die Angiogenese zu induzieren. Kurz gesagt, die HUVEC-Zellen wurden in der wachstumsfaktorreduzierten Basalmembranmatrix (Matrigel, 356231, Corning, USA) ausgesät und mit verschiedenen Hydrogelextrakten inkubiert. Anschließend wurden die röhrenförmigen Strukturen beobachtet und quantitativ analysiert. Außerdem wurde die Expression von VEGF, Hypoxie-induzierbarem Faktor-1α (HIF-1α), bFGF und Angiopoietin-1 (Ang-1) mittels RT-qPCR gemessen. Alle in RT-qPCR verwendeten Primersequenzen sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt. Nach 7-tägiger Kultivierung wurde eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, um eine Neovaskularisation wie zuvor beschrieben nachzuweisen [29].

Die Migrationsaktivität von MC3T3-E1 (CRL-2593, ATCC, USA) wurde durch Transwell- und In-vitro-Kratzwundentests bestimmt. Die experimentellen Verfahren waren die gleichen wie oben. MC3T3-E1-Zellen (5 × 104 Zellen pro Vertiefung) wurden mit konditioniertem Makrophagenmedium und Komplettmedium (1:1), das 10 mmol/L β-Glycerophosphat-Dinatriumsalz, 50 μg/ml Ascorbinsäure und enthielt, co-kultiviert 10 nmol/L Dexamethason. Die ALP-Färbung wurde mit dem BCIP/NBT-Färbekit gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Am 14. Tag wurden die fixierten Zellproben zur ARS-Färbung in ARS-Lösung getaucht. Die Zellen wurden 30 Minuten lang unter Schütteln mit 10 % Cetylpyridiniumchlorid co-inkubiert. Nach 15-minütiger Zentrifugation wurde der gesammelte Überstand jeder Probe bei einer Wellenlänge von 562 nm gemessen. Nach 7-tägiger Kokultivierung wurden die Zellen fixiert und mit 5 % Ziegenserum inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit primären Zielantikörpern gegen den Runt-assoziierten Transkriptionsfaktor 2 (Runx2; D1L7F, Cell Signaling) und Osteopontin (OPN; 22952–1-AP, ProteinTech) inkubiert. Nach der Inkubation mit dem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper und der Gegenfärbung mit DAPI wurden sie mit CLSM (TCS SP8, Leica, Deutschland) beobachtet.

Die Expressionsniveaus von Runx2, Kollagen Typ I (Col-1), OPN und Osteocalcin (OCN) in MC3T3-E1-Zellen wurden mit qRT-PCR untersucht. Kurz gesagt, die Gesamt-RNA wurde aus den Zellen isoliert und die cDNA wurde unter Verwendung eines HiScript III RT SuperMix-Reverse-Transkriptions-Kits synthetisiert. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die ausgewählten Gene sind auch in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt.

Die Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee des Zhongnan Hospital der Universität Wuhan genehmigt (Nr. ZN2022282). Wie in Abb. 1b gezeigt, wurde ein Tiermodell mit Schädelknochendefektverletzungen konstruiert. Sechsunddreißig männliche Ratten (200–220 g) wurden zufällig in vier Gruppen eingeteilt: Kontrolle, CG, CG/PHA und CG/PHA/5 % PBT. Das Flussdiagramm für Tierversuche und die entsprechenden Tests sind in der Zusatzdatei 2 dargestellt: Abb. S1. Zwei Wochen nach der Operation wurden 3 Ratten in jeder Gruppe mit überschüssigem Pentobarbital-Natrium getötet, und die Hälfte des Schädelknochens wurde geerntet und zur weiteren Analyse 48 Stunden lang bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurden die Proben entkalkt, indem sie etwa 4 Wochen lang bei 37 °C in 10 % EDTA eingeweicht wurden. Nach der Einbettung in Paraffin wurde der Knochendefektbereich mit Membranen geschnitten, um Paraffinschnitte mit einer Dicke von 5 μm herzustellen. Um die lokale Entzündungsreaktion im Anfangsstadium nach der Implantation zu bewerten, wurden iNOS und CD206 als spezifische Marker für die doppelt markierte Immunfluoreszenzfärbung ausgewählt, um den Phänotyp der infiltrierenden Makrophagen zu beobachten. Darüber hinaus wurde eine immunhistochemische Färbung des entzündungsfördernden Faktors TNF-α und des entzündungshemmenden Zytokins IL-10 durchgeführt, um die entzündungshemmenden Eigenschaften des piezoelektrischen Hydrogels während der Knochenheilung zu beurteilen. Darüber hinaus wurden immunhistochemische und Immunfluoreszenzfärbungen für den Proangiogenesefaktor VEGF/CD31 und das proosteogene Differenzierungszytokin Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2)/Runx2 durchgeführt, um die Vaskularisierung und osteogene Differenzierung der Proben durch piezoelektrische Hydrogelbehandlung während des Knochens zu bewerten Heilung.

Acht Wochen nach der Operation wurden 3 Ratten in jeder Gruppe wie oben erwähnt getötet und der gesamte Schädelknochen wurde mit einem Mikro-CT-System (SkyScan 1276-System, Bruker, Deutschland) mit den folgenden Einstellungen gescannt: Spannung 200 kV; Strom, 65 μA; und Filterung, 0,25 mm Aluminium mit einer Bildpixelgröße von 6,5 μm. Das Knochengewebevolumen/Gesamtgewebevolumen (BV/TV) und die Knochenmineraldichte (BMD) wurden basierend auf den rekonstruierten Mikro-CT-Bildern analysiert. Die letzten drei Ratten wurden getötet und die Proben zur histologischen Analyse entnommen. Die Gewebeproben wurden geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt, um die Knochenreparaturfähigkeit zu bewerten. Anschließend wurden die Trichrom-Färbung nach Masson und die Trichrom-Färbung nach Goldner durchgeführt, um die Reifung des regenerierten Knochengewebes im Defektbereich sichtbar zu machen. Bei der Trichrom-Färbung nach Masson wurden die roten Bereiche als mineralisiertes Kollagen (reife Knochenmatrix) betrachtet, während die blauen Bereiche als nicht mineralisiertes Kollagen (unreife Knochenmatrix) betrachtet wurden. Bei der Goldner-Trichrom-Färbung wurden die orange/rot gefärbten Bereiche als Osteoid (unreifer Knochen) betrachtet, während die dunkelgrün gefärbten Bereiche als mineralisierter Knochen (reifer Knochen) betrachtet wurden. Zusätzlich wurden die In-vivo-Osteogenese und die Vaskularisierung in den Knochendefekten durch immunhistochemische Färbung von Col-1, Runx2, OPN, CD31 und CD34 wie zuvor beschrieben analysiert [32]. Alle gefärbten Proben wurden mit einem Mikroskop abgebildet und mit der ImageJ-Software halbquantifiziert.

Alle Experimente in dieser Arbeit wurden mindestens dreimal durchgeführt. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt und die Diagramme wurden mit der Software Origin 2018 (Origin Lab Corporation, USA) erstellt. Die Analysen wurden mit dem Student-t-Test (ungepaart und zweiseitig), einer einfaktoriellen oder zweifaktoriellen ANOVA, gefolgt von Tukey post hoc, durchgeführt. Ein P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Wie in den Abb. gezeigt. In den Abbildungen 1a und 2a wurde ein poröses piezoelektrisches Hydrogelgerüst hergestellt, indem PDA-modifizierte keramische HA- und piezoelektrische BaTiO3-Nanopartikel in CG-Hydrogele dotiert wurden. Das CG-Hydrogel mit 10 Gew.-% PDA-modifizierten HA-Nanopartikeln wurde CG/PHA genannt. Die CG-Hydrogele, die 10 Gew.-% PDA-modifizierte HA-Nanopartikel und 5 Gew.-% oder 10 Gew.-% PDA-modifizierte BaTiO3-Nanopartikel enthielten, wurden CG/PHA/5 % PBT bzw. CG/PHA/10 % PBT genannt . Das CG-Hydrogel wies eine glatte Oberfläche auf und die Oberfläche der Hydrogele mit eingearbeiteten HA- und piezoelektrischen BaTiO3-Nanopartikeln zeigte das Vorhandensein von Nanopartikeln. Die Oberflächenrauheit der Hydrogele nahm mit zunehmender Anzahl der Nanopartikel zu, die Porosität des Hydrogels änderte sich jedoch nicht. Um das Problem der Nanopartikeldispersion zu lösen, wurden die HA- und piezoelektrischen BaTiO3-Nanopartikel mit PDA modifiziert. Eine Schicht, die die Oberfläche der BaTiO3-Nanopartikel bedeckt, war durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) deutlich zu erkennen (Zusatzdatei 2: Abb. S2). Gemäß Abb. 2b zeigte die Energiedispersionsspektroskopie (EDS)-Kartierung der CG/PHA/5 % PBT-Probe, die mit HA-Nanopartikeln (10 % Gew./Gew.) und piezoelektrischen BaTiO3-Nanopartikeln (5 % Gew./Gew.) dotiert war, dass die speziellen Elemente (Ca und P in HA vorhanden; Ba und Ti in BaTiO3 vorhanden) waren gleichmäßig verteilt, was darauf hinweist, dass die HA- und piezoelektrischen BaTiO3-Nanopartikel gleichmäßig im Hydrogel verteilt waren, ohne zu fokussieren. Aufgrund der Einführung von HA-Nanopartikeln in die Hydrogele konnte ein charakteristischer Peak bei 2θ = 31,7° beobachtet werden (Abb. 2c). Der charakteristische Peak wurde den (211)-Reflexionsebenen zugeordnet und stimmte mit der gemeldeten HA-Phase überein (JCPDS-Karte Nr. 01–74-0566). Darüber hinaus gehörten für die Beugungskurve von PHA/PBT die Aufspaltungspeaks bei etwa 45,4° zu den (002)-Ebenen für die tetragonale Phase von BaTiO3 (JCPDS-Karte Nr. 05–0626), was seine ferroelektrischen/piezoelektrischen Eigenschaften bewies [33 ]. Darüber hinaus nahm die Intensität der Peaks mit zunehmendem PBT-Gehalt in den Hydrogelen zu. Die FTIR-Spektren der piezoelektrischen Hydrogele sind in Abb. 2d dargestellt. Es war klar, dass die Bande bei 1272 cm−1 der C-O-C-Streckung zugeordnet werden konnte, die den Cs- und Gel-Komponenten zugeschrieben werden konnte. Im Vergleich zum CG-Hydrogel entsprach die Absorptionsbande bei 1510 cm−1 der Scherschwingung von N-H (Abb. 2d), was auf das Vorhandensein von PDA schließen lässt [34].

Charakterisierung der piezoelektrischen Hydrogele. a Repräsentative REM-Bilder verschiedener Hydrogelproben, die roten Pfeile stellen piezoelektrische Nanopartikel dar. b EDS-Elementkartierung des piezoelektrischen Hydrogels aus CG/PHA/5 % PBT. XRD (c), FTIR (d), rheologische Kurve (e) und Elastizitätsmodul (f) verschiedener Hydrogelproben. g Die Ausgangsspannung verschiedener Hydrogelproben bei 10 Hz und 1 kP Druck. *P < 0,05, verglichen mit der KG-Gruppe; #P < 0,05, verglichen mit der CG/PHA-Gruppe. CG-Chitosan/Gelatine, PHA-Polydopamin-beschichtetes Hydroxylapatit, PBT-Polydopamin-beschichtetes Bariumtitanat, SEM-Rasterelektronenmikroskop, EDS-Energiedispersionsspektroskopie, XRD-Röntgenbeugung, FTIR-Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

Der Speichermodul der piezoelektrischen Hydrogele CG, CG/PHA, CG/PHA/5 % PBT und CG/PHA/10 % PBT betrug 342,8, 408,4, 493,1 bzw. 532,2 Pa (Abb. 2e, f). Mit zunehmendem Gewichtsverhältnis von HA- und BaTiO3-Nanopartikeln stieg der Speichermodul (G′) der piezoelektrischen CG/PHA/PBT-Hydrogele (P < 0,05), was durch die Hochregulierung der Vernetzungsdichte in verursacht werden kann CG/PHA/PBT-Hydrogele. Um die Stromerzeugungsleistung der piezoelektrischen Hydrogele CG/PHA/PBT zu ermitteln, wurde ein Spannungsausgangstest durchgeführt. Alle Verbundhydrogele zeigten eine bestimmte Erzeugungskapazität (Abb. 2g), und die Spannungsabgabe der Hydrogele CG, CG/PHA, CG/PHA/5 % PBT und CG/PHA/10 % PBT betrug ungefähr 0,2, 0,25, 0,6 bzw. 0,8 V. Die Stromerzeugungseigenschaften von CG/PHA-Hydrogelen mit 5–10 Gew.-% BaTiO3 spiegelten eine erhöhte Fähigkeit zur Eigenstromerzeugung wider. Wie in Abb. 1c gezeigt, kann der mögliche autarke Mechanismus, der dem piezoelektrischen Signal in den CG/PHA/PBT-Hydrogelen zugrunde liegt, wie folgt beschrieben werden. Die Dipole in den BaTiO3-Nanopartikeln sind in den piezoelektrischen Hydrogelen CG/PHA/PBT in die gleiche Richtung ausgerichtet. Die elektrische Polarisation wird in Richtung der ausgerichteten Dipole dargestellt und kann ein piezoelektrisches Potenzial in den piezoelektrischen BaTiO3-Nanopartikeln erzeugen. Ohne äußere Reize herrscht im Hydrogel ein positives und negatives Ladungsgleichgewicht. Sobald ein Druck-/Dehnungsreiz auf die piezoelektrischen Hydrogele ausgeübt wird, fließen die Elektronen in den Hydrogelen aus dem Hydrogel. Sobald der Druck/die Spannung verschwindet, fließen die angesammelten freien Ladungen zurück in die piezoelektrischen Hydrogele. Während dieser Aktionsreihe kann ein positiver und ein negativer Strom beobachtet werden. Wenn kontinuierlich ein Kraftreiz ausgeübt und wieder freigegeben wird (wodurch das Gel in sein ursprüngliches Volumen zurückkehren kann), wird ein typisches sinusförmiges elektrisches Signal beobachtet, wie in Abb. 2g dargestellt.

Diese Ergebnisse deuten auf die erfolgreiche Synthese eines Hydrogel-Gerüstmaterials mit piezoelektrischen Eigenschaften hin. Dieses Gerüstmaterial kann unter äußerem Druck eine wirksame elektrische Stimulation bewirken und eine gute elektrische Mikroumgebung für die Geweberegeneration bilden.

Während des Knochenheilungsprozesses sind Entzündung, oxidativer Stress, Angiogenese und Osteogenese eng miteinander verbunden. Die Immunreaktion im ersten Stadium nach der Einbettung des Gerüsts ist für die Knochengewebereparatur äußerst wichtig. Überlange Immunreaktionen während des Knochenreparaturprozesses verzögern die Knochenregeneration und führen schließlich zur Pseudarthrose. Darüber hinaus beeinflusst die Transformation von Makrophagen-Phänotypen während einer Entzündung die nachfolgende Ereigniskaskade, die das Schicksal implantierter Gerüste bestimmt. Abbildung 3a zeigt, wie die piezoelektrischen Hydrogele mit Makrophagen kokultiviert werden, und zeigt die phänotypischen Veränderungen und immunmodulatorischen Wirkungen von Makrophagen unter dem Einfluss der piezoelektrischen Hydrogele. Vor der Durchführung der Zellexperimente wurde die Zytokompatibilität der piezoelektrischen Hydrogele mit RAW 264.7-Zellen mit dem CCK-8-Kit-Test bestimmt. Wie in Abb. 3b zu sehen ist, zeigten keine piezoelektrischen Hydrogelextraktgruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten toxische Wirkungen auf RAW 264.7-Zellen. Die Zelllebensfähigkeit der piezoelektrischen Hydrogel-Extraktgruppen war ähnlich der der unbehandelten Gruppe (P > 0,05). Um die CCK-8-Ergebnisse weiter zu bestätigen, wurde die Zellapoptose durch Färbung lebender/toter Zellen analysiert (Abb. 3c, d). Sowohl zweidimensionale (2D) als auch dreidimensionale (3D) Bilder von RAW 264.7-Zellen auf den piezoelektrischen Hydrogelen zeigten eine hohe Überlebensrate und keine apoptotischen Zellen. Darüber hinaus konnte das Migrationsverhalten von Makrophagen in der 3D-Kultur beobachtet werden. Unter den vier Gruppen von Hydrogel-Gerüstmaterialien wanderten die RAW 264.7-Zellen in der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe am tiefsten in den Hohlraum des Hydrogels.

In-vitro-Bewertung der immunmodulatorischen Eigenschaften der piezoelektrischen Hydrogele. a Schematische Darstellung der Immunregulation durch die piezoelektrischen Hydrogele. b Bewertung der Zytokompatibilität der piezoelektrischen Hydrogele. c–d 2D- und 3D-Färbung lebender und toter Zellen von Makrophagen (RAW 264.7-Zellen), die mit den piezoelektrischen Hydrogelen kokultiviert wurden. Maßstabsbalken: 200 μm (c), 100 μm (d). e Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von RAW 264.7-Zellen auf Hydrogelen. F-Aktin (grün) ist ein faseriges Aktin, das das Skelett der Zellen darstellt, F4/80 (rot) ist das Zelloberflächen-Glykoprotein und der Marker reifer Mausmakrophagen, DAPI (blau) steht für den Zellkern. Maßstabsbalken: 25 μm. f Repräsentative durchflusszytometrische Punktdiagramme, die Zelloberflächenmarker von RAW 264.7-Zellen, einschließlich CD86 und CD206, zeigen. g Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von iNOS (rot) und CD206 (grün) in RAW 264.7-Zellen auf Hydrogelen am 2. Tag. Maßstabsleiste: 25 μm. h Relative mRNA-Expressionsniveaus von entzündungshemmenden Genen und proinflammatorischen Genen von Makrophagen unter der piezoelektrischen Hydrogelstimulation für 2 Tage. *P < 0,05, verglichen mit der Kontrollgruppe; #P < 0,05, verglichen mit der CG-Gruppe; $P < 0,05, verglichen mit der CG/PHA-Gruppe; @P < 0,05, verglichen mit der CG/PHA/5 %PBT-Gruppe. CG Chitosan/Gelatine, PHA Polydopamin-beschichtetes Hydroxylapatit, PBT Polydopamin-beschichtetes Bariumtitanat, IL-6 Interleukin-6, TNF-α Tumornekrosefaktor-α, iNOS induzierbare Stickoxidsynthase, IL-4 Interleukin-4, IL- 10 Interleukin-10, Arg1 Arginase 1

Die immunmodulatorischen Eigenschaften der piezoelektrischen Hydrogele wurden untersucht. Abbildung 3e zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von F-Actin und F4/80 in RAW 264.7-Zellen auf piezoelektrischen Hydrogelgerüsten. Die doppelt markierten F-Actin- und F4/80-Immunfluoreszenzbilder zeigten, dass Makrophagen an der Oberfläche des CG-Hydrogels hafteten und die Zellen in der Kontrollgruppe eine spiegeleiartige Form mit vielen Filopodien aufwiesen, während die Zellen in der CG/PHA Die Gruppe hatte ein typisch rundes Aussehen. Darüber hinaus nahmen die an der Oberfläche der CG/PHA/5 %PBT- und CG/PHA/10 %PBT-Gruppen haftenden Makrophagen eine spindelartige Form an. Die Ergebnisse der Zellausbreitungsfläche und des Spindelzellverhältnisses zeigten, dass Makrophagen in der CG- und Kontrollgruppe eine M1-ähnliche Morphologie und eine große Ausbreitungsfläche aufwiesen, während die Makrophagen in den Gruppen CG/PHA/5 % PBT und CG/PHA/10 % PBT eine M1-ähnliche Morphologie und eine große Ausbreitungsfläche aufwiesen wies eine spindelartige Form auf, die als typisch für den M2-Phänotyp gilt. Daher verursachten die immunmodulatorischen Wirkungen der piezoelektrischen Hydrogele in den piezoelektrischen Hydrogelgruppen eine größere Anfälligkeit für die Aktivierung von Makrophagen vom M2-Typ als in den nicht-piezoelektrischen Hydrogelgruppen.

Darüber hinaus wurde Durchflusszytometrie verwendet, um die Makrophagenpolarisierung zu bewerten. Die CD86-positiven Zellverhältnisse der Kontroll-, CG-, CG/PHA-, CG/PHA/5 %PBT- und CG/PHA/10 %PBT-Gruppen betrugen 21,7 %, 21,4 %, 20,0 %, 8,8 % bzw. 11,9 %. Die CD206-positiven Zellverhältnisse der Kontroll-, CG-, CG/PHA-, CG/PHA/5 %PBT- und CG/PHA/10 %PBT-Gruppen betrugen 9,9 %, 10,6 %, 13,5 %, 21,1 % bzw. 17,7 % (Abb. 3f, Zusatzdatei 2: Abb. S3a). Durchflusszytometrische Färbung und quantitative Ergebnisse zeigten, dass die piezoelektrischen Hydrogele die Expression von CD86 (ein M1-Makrophagen-Oberflächenmarker) signifikant reduzierten und die CD206-Expression (ein M2-Makrophagen-Oberflächenmarker) verstärkten (P < 0,05). In den Kontroll-, CG- und CG/PHA-Gruppen wurde eine höhere Expression von CD86 beobachtet als in Makrophagen, die den CG/PHA/5 % PBT- und CG/PHA/10 % PBT-Gruppen ausgesetzt waren. Unterdessen war die Anzahl der CD206+ M2-Makrophagen in den Gruppen CG/PHA/5 % PBT und CG/PHA/10 % PBT im Vergleich zu den Kontroll-, CG- und CG/PHA-Gruppen erhöht (P < 0,05; Zusatzdatei 2: Abb. S3a). Die Immunfluoreszenz- und Western-Blot-Ergebnisse ähnelten denen der Durchflusszytometrie (Abb. 3g, Zusatzdatei 2: Abb. S3b).

Zur Untersuchung des Zytokinprofils wurden RT-qPCR-Experimente durchgeführt (Abb. 3h). Die RT-qPCR-Ergebnisse zeigten eine signifikante Herunterregulierung entzündungsfördernder Zytokine wie IL-6, TNF-α, iNOS und CD86 in den Gruppen CG/PHA/5 % PBT und CG/PHA/10 % PBT (P < 0,05). Unterdessen war die Expression entzündungshemmender Genmarker (IL-4, IL-10, Arg1 und CD206) in diesen Gruppen im Vergleich zu den CG/PHA-, CG- und Kontrollgruppen deutlich hochreguliert (P < 0,05). Darüber hinaus zeigte die Sekretion von BMP-2, TGF-β1, VEGF und bFGF, dass die elektrische Mikroumgebung die Akkommodationseffekte bei der Beschleunigung der pro-regenerationsfördernden Zytokinsekretion durch Makrophagen erhöhte (P <0,05, Zusatzdatei 2: Abb. S4).

Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass die elektrischen Reize und die elektrische Mikroumgebung, die von den piezoelektrischen Hydrogelen CG/PHA/PBT bereitgestellt werden, die Immunität regulieren und die Polarisation von M2-Makrophagen sowie die entzündungshemmende und heilungsfördernde Zytokinsekretion durch Makrophagen fördern könnten. Da die biologische Leistung des CG/PHA/5 %PBT-Hydrogels besser war als die des piezoelektrischen CG/PHA/10 %PBT-Hydrogels, konzentrierten wir uns in nachfolgenden Experimenten auf das CG/PHA/5 %PBT-Hydrogel.

Um die chemotaktische Reaktion von HUVECs auf das Co-Kulturmedium aus der Co-Kultur von Makrophagen und den piezoelektrischen Hydrogelen zu untersuchen, wurden Transwell-Migrations- und Kratzwundeheilungstests durchgeführt. Wie in Abb. 4a-c und Zusatzdatei 2: Abb. S5 gezeigt, förderte das Co-Kulturmedium die Migration und Infiltration von HUVECs. Diese Verhaltensänderungen wirken sich sehr positiv auf die Angiogenese während der Knochenheilung und -reparatur aus [35, 36]. Die HUVEC-Migrationskapazität in den Gruppen CG, CG/PHA und CG/PHA/5 % PBT war höher als die in der Kontrollgruppe (P < 0,05), da das Co-Kulturmedium aus Makrophagen und den Gruppen CG, CG/PHA und CG/PHA/5 % PBT-Hydrogele hatten einen positiven Effekt auf die Zellmigration. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass diese Hydrogele die Sekretion von BMP-2, VEGF und bFGF in Makrophagen fördern können (Zusatzdatei 2: Abb. S4). Das Co-Kulturmedium aus Makrophagen und den piezoelektrischen Hydrogelen CG/PHA/5 % PBT hatte die beste Wirkung hinsichtlich der Förderung der HUVEC-Migration und -Infiltration. Piezoelektrische Hydrogele weisen ein erhebliches Potenzial für die Knochenangiogenese bei der Knochenregeneration auf. Diese Daten deuten darauf hin, dass die piezoelektrischen Hydrogele aus CG/PHA/5 % PBT eine hervorragende elektrische Mikroumgebung für die Knochenvaskularisierung bieten können.

In-vitro-Bewertung der angiogenen Fähigkeit der piezoelektrischen Hydrogele. a Schematische Darstellung des Experiments mit proangiogenetischen Zellen. Zunächst wurde das piezoelektrische Hydrogel zusammen mit Makrophagen kultiviert; Anschließend wurden Gefäßendothelzellen unter Verwendung des Co-Kulturmediums aus Makrophagen kultiviert. b Repräsentative digitale und mikroskopische Bilder der in die untere Kammer migrierten HUVECs-Zellen, nachdem das Makrophagenmedium separat in die untere Kammer gegeben und 24 Stunden lang kultiviert wurde. Maßstabsbalken: 200 μm. c Repräsentative mikroskopische Bilder von HUVECs, nachdem die Zellen 24 Stunden lang mit verschiedenen Makrophagenmedien kokultiviert wurden. Maßstabsbalken: 200 μm. d Repräsentative Fluoreszenzbilder und quantitative Analyse der HUVEC-Röhrenbildung, nachdem die Zellen 8 Stunden lang mit verschiedenen Makrophagenmedien kokultiviert wurden. Der Prozentsatz der Blutgefäßfläche ist die Gefäßdichte von Gefäßendothelzellen in einem einzelnen Bild, die Gesamtzahl der Verbindungen ist die Zellüberschneidung zwischen Gefäßendothelzellen in einem einzelnen Bild. Die Röhrenbildung wurde mit AngioTool (National Cancer Institute, NIH) quantifiziert Prozentsatz der Blutgefäßfläche und die Gesamtzahl der Übergänge. Maßstabsbalken: 250 μm. e Relative mRNA-Expressionsniveaus von Angiogenese-bezogenen Genen in HUVECs, nachdem die Zellen 7 Tage lang mit verschiedenen Makrophagenmedien, einschließlich VEGF, HIF-1α, bFGF und Ang-1, kokultiviert wurden. f Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von CD31 (rot), VEGF (grün) und Kernen (blau) in HUVECs, nachdem die Zellen 7 Tage lang mit verschiedenen Makrophagenmedien kokultiviert wurden. Maßstabsbalken: 25 μm. *P < 0,05, verglichen mit der Kontrollgruppe; #P < 0,05, verglichen mit der CG-Gruppe; $ P < 0,05, verglichen mit der CG/PHA-Gruppe. CG-Chitosan/Gelatine, PHA-Polydopamin-beschichtetes Hydroxylapatit, PBT-Polydopamin-beschichtetes Bariumtitanat, VEGF-Gefäßendothel-Wachstumsfaktor, HIF-1α-Hypoxie-induzierbarer Faktor-1α, bFGF-basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Ang-1-Angiopoietin-1, HUVECs menschliche Nabelschnurvene Endothelzellen

Die Fähigkeit, Blutgefäße nach einer Knochenverletzung zu bilden, spielt eine entscheidende Rolle bei der Rekonstruktion von Knochendefektgewebe, da sie das beschädigte Gewebe mit Blut, Nährstoffen und Sauerstoff versorgt und unkontrollierte Entzündungsreaktionen an der beschädigten Stelle lindert [34, 37, 38]. Daher wurde ein Matrigel-Röhrenbildungstest durchgeführt, um die Fähigkeit der piezoelektrischen CG/PHA/PBT-Hydrogele zu bewerten, die Bildung neuer Gefäße zu fördern. HUVECs, die mit dem Co-Kulturmedium aus Makrophagen und den piezoelektrischen Hydrogelen gemeinsam kultiviert wurden, zeigten mehr Gefäßröhren (Abb. 4d). Allerdings wurden in den Gruppen CG und CG/PHA einige unvollständige röhrenartige Strukturen beobachtet. Der Prozentsatz der Blutgefäßfläche und die Gesamtzahl der Verbindungen waren in der CG/PHA/5 %PBT-Gruppe signifikant erhöht (P < 0,05, Abb. 4d), was darauf hindeutet, dass piezoelektrische Hydrogele aus CG/PHA/5 % PBT in Kombination mit Makrophagen dies könnten fördern die Angiogenese in vitro. Alle diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Co-Kulturmedium aus Makrophagen und den piezoelektrischen Hydrogelen CG/PHA/5 % PBT die HUVEC-Migration und die Blutgefäßbildung fördern könnte.

Die Gene VEGF, HIF-1α, bFGF und Ang-1 sind Angiogenese-bezogene Gene, deren Expressionsprofil eng mit der Angiogenese zusammenhängt (31, 39). Als die HUVECs mit Co-Kulturmedium aus Makrophagen und den piezoelektrischen Hydrogelen kokultiviert wurden, zeigte die CG/PHA/5 % PBT-Gruppe im Vergleich zur Kontroll-, CG- und CG/PHA-Gruppe eine deutlich hochregulierte Expression dieser Gene (P < 0,05, Abb. 4e), was darauf hindeutet, dass das piezoelektrische CG/PHA/PBT-Hydrogel in vitro eine gute angiogene Bioaktivität aufwies. Die höchste Expression der Angiogenese-bezogenen Gene wurde in der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe beobachtet, gefolgt von der CG/PHA-, CG- und Kontrollgruppe. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kontroll- und der KG-Gruppe (P > 0,05). Nach einer Woche Co-Kultur wurde weiterhin eine CD31- und VEGF-Doppelimmunfluoreszenzfärbung durchgeführt, um die angiogene Wirkung des piezoelektrischen CG/PHA/5 % PBT-Hydrogels zu bewerten. Wie in Abb. 4f gezeigt, war die CD31- und VEGF-Expression in HUVECs in der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe signifikant höher als in den Kontroll-, CG- und CG/PHA-Gruppen. Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbung stimmten mit der RT-qPCR-Analyse überein. Daher kann die Regulierung der Immunmikroumgebung durch piezoelektrisches Hydrogel die Angiogenese wirksam fördern.

Um die Wirkung des Co-Kulturmediums aus Makrophagen und piezoelektrischen Hydrogelen auf Osteoblasten zu bewerten, wurden zahlreiche biologische Funktionsbewertungen durchgeführt, wie z. B. Zellmigration, Osteodifferenzierung und Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM) (Zusatzdatei 2: Abb. S6a). Sowohl Transwell- als auch Scratch-Wundheilungstests wurden verwendet, um die Migration von Osteoblastenzellen (MC3T3-E1) zu analysieren, die mit Co-Kulturmedium aus Makrophagen und den piezoelektrischen Hydrogelen behandelt wurden. Wie in der Zusatzdatei 2: Abb. S6b-c dargestellt, war die Migration von MC3T3-E1-Zellen in der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe am höchsten, während die Migration in den CG- und CG/PHA-Gruppen etwas höher war als in die Kontrollgruppe (P < 0,05). Diese Daten zeigten, dass die piezoelektrischen Hydrogele aus CG/PHA/5 % PBT die Zellmigration von MC3T3-E1 stimulieren könnten.

Die osteogene Differenzierung von MC3T3-E1-Zellen im Co-Kulturmedium aus Makrophagen und piezoelektrischen Hydrogelen wurde durch ALP-Färbung, ARS-Färbung, RT-qPCR-Assay und Immunfluoreszenzfärbung bewertet. ALP ist ein Bioindikator für die osteogene Differenzierung im Anfangsstadium und wurde zur Bewertung der Differenzierung durch Färbung und quantitative Bewertung verwendet. Die in der Zusatzdatei 2: Abb. S6d gezeigten Fotos zeigen, dass das Co-Kulturmedium aus Makrophagen und den piezoelektrischen Hydrogelen CG/PHA/5 % PBT im Vergleich zu den Tagen 7 und 14 die intensivste ALP-Färbung und ALP-Aktivität aufwies andere drei Gruppen (P < 0,05). Mithilfe der ARS-Färbung wurde der Mineralisierungsstatus verschiedener Behandlungsgruppen untersucht. Wie in der Zusatzdatei 2: Abb. S6e gezeigt, hafteten alle Zellen an dem osteoinduktiven Medium und dem Co-Kulturmedium von Makrophagen und den piezoelektrischen Hydrogelen und zeigten positive Färbeergebnisse am 14. und 21. Tag. Die CG/PHA/5 % PBT-Gruppe drückte die beste osteogene Fähigkeit aus. OD-Werte wurden gemessen, um die ARS-Färbung quantitativ zu bewerten, wobei ein Mikroplattenlesegerät bei 562 nm verwendet wurde; Die Ergebnisse stimmten mit denen der Lichtmikroskopie überein.

Darüber hinaus wurde die Expression osteogener Gene wie Runx2, Col-1, OPN und OCN evaluiert, um die proosteogene Differenzierung von MC3T3-E1-Zellen im Co-Kulturmedium aus Makrophagen und piezoelektrischen Hydrogelen zu validieren. Wie in der Zusatzdatei 2: Abb. S6f gezeigt, wurde in der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe eine stark hochregulierte Expression dieser Gene im Vergleich zu der in der Kontrolle (24-Well-Platten), CG und CG/PHA festgestellt Gruppen am 14. Tag (P < 0,05). Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte auch, dass die im Co-Kulturmedium aus Makrophagen und piezoelektrischen Hydrogelen kultivierten MC3T3-E1-Zellen höhere Mengen an Runx2- und OPN-Proteinen exprimierten als andere Gruppen (Zusatzdatei 2: Abb. S6g). Alle diese Ergebnisse zeigen, dass die piezoelektrischen Hydrogele aus CG/PHA/5 % PBT eine zufriedenstellende Fähigkeit besaßen, die osteogene Differenzierung von MC3T3-E1-Zellen zu fördern.

Im Hinblick auf die biologische Leistung verbesserten die piezoelektrischen Hydrogele die Osteogenese erheblich und induzierten durch mehrere biochemische und biophysikalische Eigenschaften effektiv die Umstellung von entzündungsfördernden M1-Makrophagen auf den entzündungshemmenden M2-Phänotyp. Um die Anwendbarkeit der piezoelektrischen Hydrogele für die Knochenreparatur weiter zu bewerten, haben wir ein Rattenschädeldefektmodell nach einer zuvor beschriebenen Methode erstellt [18]. Die Hydrogele (piezoelektrische Hydrogele CG, CG/PHA und CG/PHA/5 % PBT) wurden in die Defektstellen implantiert. Die Ratten, die kein Hydrogel erhielten, bildeten die Blindkontrollgruppe. Die in die Knochenverletzungsstellen implantierten piezoelektrischen Hydrogele könnten an diesen Stellen eine Barriere aufbauen. Die anschließende Neovaskularisation an der Defektstelle führte schließlich zu einer großflächigen Knochenregeneration.

Die Makrophagenpolarisierung an den Defektstellen wurde zwei Wochen nach der Implantation durch immunhistochemische Färbung nachgewiesen. Wie in der Zusatzdatei 2: Abb. S7a gezeigt, zeigte der In-situ-Knochengewebedefekt einen geringeren Anteil an iNOS-positiven Zellen und einen höheren Anteil an CD206-positiven Zellen in der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe, was auf die Entwicklung von hindeutet eine entzündungshemmende Reaktion nach der Implantation der piezoelektrischen Hydrogele. TNF-α, ein häufiger entzündungsfördernder Faktor, und IL-10, ein entzündungshemmender Faktor, stehen in engem Zusammenhang mit der Entzündungsreaktion an der verletzten Stelle. Daher wurden immunhistochemische Tests auf TNF-α und IL-10 durchgeführt, um die anfängliche Entzündungsreaktion im Knochenreparaturprozess zu untersuchen. Im Vergleich zu den Gruppen CG, CG/PHA und CG/PHA/5 % PBT war der proinflammatorische Faktor TNF-α in der Kontrollgruppe signifikant höher. Im Gegensatz dazu war der entzündungshemmende Faktor IL-10 in der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe hochreguliert (Zusatzdatei 2: Abb. S7b). Diese Daten bestätigten, dass das CG/PHA/5 % PBT-Hydrogel die M1-zu-M2-Verschiebung von Makrophagen stärker begünstigt als die CG- und CG/PHA-Hydrogelgerüste.

Durch die Regulierung der M1-zu-M2-Polarisation von Makrophagen kann die Entzündungsreaktion rund um die Knochenregeneration in situ effektiv umgestaltet werden. Auch die Regeneration des Knochengewebes im Anschluss an die Immunregulation sollte eingeleitet werden. VEGF und BMP-2 fungieren als starke Induktoren der Angiogenese und Osteogenese und werden immer von M2-Makrophagen im Stadium der Knochenvaskularisierung sezerniert [40]. Um die Rolle des piezoelektrischen CG/PHA/PBT-Hydrogels bei der Induktion von Angiogenese und Osteogenese zu überprüfen, wurde zwei Wochen nach der Operation eine immunhistochemische Analyse von VEGF und BMP-2 durchgeführt. In der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe wurde eine höhere Expression von VEGF und BMP-2 beobachtet (Zusatzdatei 2: Abb. S7b), was ein größeres Potenzial zur Erleichterung der Vaskularisierung und Knochenbildung zeigt. Darüber hinaus wurde zwei Wochen nach der Operation auch eine Immunfluoreszenzfärbung von CD31 und Runx2 durchgeführt, um die angiogenen und osteogenen Fähigkeiten der piezoelektrischen Hydrogele zu untersuchen. In der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe wurde eine höhere Expression von CD31 und Runx2 beobachtet (Zusatzdatei 2: Abb. S7c), was ein größeres Potenzial zur Erleichterung der Vaskularisierung und des Knochenumbaus zeigt. Die von den piezoelektrischen Hydrogelen erzeugten elektrischen Signale könnten für die Umwandlung des Makrophagen-M1-Phänotyps in den M2-Phänotyp wirksam sein, indem sie die VEGF-, CD31-, BMP-2- und Runx2-Expression verstärken, was eine akkommodierende Mikroumgebung für osteogene Differenzierung und Immunmodulation schaffen könnte. Daher kann die durch piezoelektrische Hydrogele induzierte knochenimmunregulatorische Mikroumgebung endogene mesenchymale Stammzellen (MSCs) in Osteoblasten differenzieren und ihnen eine schnelle Knochenregeneration ermöglichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das piezoelektrische Hydrogel eine beträchtliche Fähigkeit zeigte, die Reparatur von Schädelknochen zu erleichtern.

Um die durch das piezoelektrische Hydrogel induzierte Osteogenese im Langprofil systematisch zu testen, wurde der neu gebildete Knochen mittels Mikro-CT gescannt. In Abb. 5a zeigten die verletzten Schädelknochen, auf die die piezoelektrischen Hydrogele aufgetragen wurden, sowohl 4 als auch 8 Wochen nach der Implantation eine bessere Reparatur als die Kontrollgruppe (P < 0,05). Die Daten zeigten, dass nach der piezoelektrischen Hydrogelimplantation mit CG/PHA/5 % PBT im Vergleich zur Kontroll-, CG- und CG/PHA-Gruppe viel mehr neuer Knochen gebildet wurde (P < 0,05). Acht Wochen nach der Implantation war der BV/TV der CG/PHA/5 %PBT-Gruppe [(35,4 ± 4,1) %] signifikant höher als der der CG/PHA-Gruppe [(24,3 ± 5,2) %] und der CG-Gruppe [ (15,8 ± 3,7) %] (P < 0,05). Die mit dem piezoelektrischen Hydrogel CG/PHA/5 % PBT implantierten Stellen zeigten auch reiferen Knochen mit einer höheren Dichte (P < 0,05). Die BMD-Daten zeigten die gleichen Tendenzen wie die BV/TV-Ergebnisse. Insgesamt wurde das verbesserte osteogene Verhalten der piezoelektrischen CG/PHA/5 % PBT-Hydrogele in Zellexperimenten gezeigt, und ihre Verbesserung der heilungsfördernden Knochenumbaufähigkeit wurde auch in einem Rattenmodell verifiziert.

Das piezoelektrische Hydrogel aus CG/PHA/5 % PBT fördert die Knochengeweberegeneration in vivo. a 2D-Mikro-CT-koronale und sagittale Bilder sowie die BV/TV- und BMD-Ergebnisse von regeneriertem Knochengewebe. Maßstabsbalken: 200 μm. b HE-, Masson-Trichrom- und Goldner-Trichrom-Färbung des Knochendefekts 8 Wochen nach der Implantation. Maßstabsbalken: 200 μm. Gelbe Pfeile und schwarze Pfeile stellen den neu gebildeten Zentralkanal bzw. die Knochenlücken innerhalb der Defektregion dar. Bei den Goldner-Trichrom-Färbungsbildern wurde in der Kontrollgruppe eine kleine Insel unreifen Knochens (Osteoid, rot) am Rand der Defektstelle entdeckt. Schwarze gestrichelte Linien definieren die Grenze des Schädelknochendefekts kritischer Größe. *P < 0,05, verglichen mit der Kontrollgruppe; #P < 0,05, verglichen mit der CG-Gruppe; $P < 0,05 im Vergleich zur CG/PHA-Gruppe. CG Chitosan/Gelatine, PHA Polydopamin-beschichtetes Hydroxylapatit, PBT Polydopamin-beschichtetes Bariumtitanat, BV/TV Knochengewebevolumen/Gesamtgewebevolumen, BMD Knochenmineraldichte, FT Fasergewebe, NB neu gebildetes Knochengewebe, HB Wirtsknochen, MB mineralisiert /reifer Knochen

Anschließend wurden histologische Färbungen, einschließlich HE-Färbung, Masson- und Goldner-Trichrom-Färbung, durchgeführt, um zu beurteilen, ob das piezoelektrische Hydrogel die Knochenbildung in vivo nach 8 Wochen verbessern kann (Abb. 5b). Als das piezoelektrische Hydrogel 8 Wochen lang eingebettet war, bestand das Kambiumgewebe in der Kontrollgruppe hauptsächlich aus grobem Fasergewebe mit einer kleinen Menge verstreuten und diskontinuierlichen neuen Knochens. Im Gegensatz dazu zeigten die histologischen Bilder 8 Wochen nach der Implantation in der CG/PHA/5 %PBT-Gruppe viel dichteres Knochengewebe als in der Kontroll-, CG- und CG/PHA-Gruppe. Es überrascht nicht, dass die CG/PHA/5 % PBT-Gruppe von allen Versuchsgruppen den höchsten Grad an Knochenmatrixbildung aufwies und 8 Wochen nach der Transplantation eine ausgezeichnete Knochenregeneration zeigte. Die CG/PHA/5 % PBT-Gruppe regenerierte nicht nur die neuen Knochenlücken und den vom Zentralkanal umgebenen Lamellenknochen, sondern der Lamellenknochen dehnte sich auch in das Knochendefektzentrum aus, um eine vollständigere Knochenstruktur zu bilden. Dieses Ergebnis liefert den histologischen Beweis dafür, dass die kontinuierliche piezoelektrische Stimulation durch das CG/PHA/5 % PBT-Hydrogel nach der Implantation MSCs an der verletzten Stelle rekrutierte und ihre Differenzierung zu Osteoblasten förderte. Bemerkenswert ist, dass die Oberseite der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe 8 Wochen nach der Implantation mit einer dünnen Schicht aus Reparaturgewebe bedeckt war, was auf die günstige Kompatibilität und langfristige biologische Abbaubarkeit unseres hergestellten piezoelektrischen Hydrogels in vivo schließen lässt. Die rote Färbung in Massons Trichrom-Färbung stellt das mineralisierte Kollagen und die reife Knochenmatrix dar, während die blaue Färbung das nicht mineralisierte Kollagen und die unreife Knochenmatrix darstellt. In dieser Studie zeigte die CG/PHA/5 %PBT-Gruppe eine starke Rotfärbung, was darauf hindeutet, dass der regenerierte Schädel in der Hydrogel-Gruppe verkalkte und ein Großteil davon ausgereift war. Bei der Trichromfärbung nach Goldner repräsentiert die dunkelgrüne Färbung den reifen Lamellenknochen und die rote Färbung den unreifen Geflechtknochen (Osteoid). Die Ergebnisse der Trichrom-Färbung nach Goldner stimmten mit den Ergebnissen der Trichrom-Färbung nach Masson überein. Unerwarteterweise ähnelte der neu gebildete Knochen in der CG/PHA/5 %PBT-Gruppe dem ursprünglichen Knochen. Alles in allem deuten die obigen Ergebnisse der histochemischen Färbung darauf hin, dass die piezoelektrischen Hydrogele über eine hervorragende osteofördernde Fähigkeit verfügen.

Anschließend wurde eine immunhistochemische Färbung von Col-1, Runx2, OPN, CD31 und CD34 (Osteogenese- und Angiogenese-bezogene Biomarker) durchgeführt, um Osteogenese und Angiogenese in vivo zu bewerten. Wie in der Zusatzdatei 2: Abb. S8 gezeigt, war es nach 8 Wochen schwierig, eine positive Proteinfärbung im Defektbereich der Kontroll- und CG-Gruppen zu beobachten, während im CG viele Flecken brauner und/oder rotbrauner Färbung beobachtet wurden /PHA/5 % PBT-Gruppe, was darauf hinweist, dass das piezoelektrische Hydrogel CG/PHA/5 % PBT die Expression von Osteogenese- und Angiogenese-bezogenen Genen beschleunigen könnte. Die Expression dieser Proteine ​​kann kontinuierlich Osteogenese, Angiogenese und ECM-Ablagerung aktivieren. Die hohe Expression von Col-1, Runx2, OPN, CD31 und CD34 deutete darauf hin, dass die mit dem piezoelektrischen Hydrogel CG/PHA/5 % PBT abgedeckten Knochendefekte eine hervorragende osteogene und angiogene Fähigkeit beibehielten.

Im Anschluss an die In-vitro- und In-vivo-Analysen wurde der molekulare Mechanismus, der der Wirkung der piezoelektrischen Hydrogelbehandlung mit CG/PHA/5 % PBT auf Makrophagen zugrunde liegt, mittels RNA-Sequenzierung bestimmt. Zwischen der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe und der CG-Gruppe wurden insgesamt 2069 differentiell exprimierte Gene (DEGs), darunter 1013 hochregulierte und 1056 herunterregulierte Gene, erhalten (Abb. 6a). Die Heatmap von DEGs, die mit der Immunregulation assoziiert sind, zeigte, dass entzündungshemmende und heilungsfördernde Gene wie Arg1, Vegfa, Tgfb1, Il10, Trem1, Mapk12, Hspa1a, Hspa1b, Cd209a, Cxcl2, Ccl3, E2f7, Cd163, Ccl4, Pbk , Il4, Mrc1 und Spp1 wurden überexprimiert, während die Osteoklastendifferenzierung in der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe herunterreguliert war (P < 0,05, Abb. 6b). Proinflammatorische Gene wie Nos2, Il6, IL1b, Tnf, Cxc11 und CD86 wurden in der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe herunterreguliert (P < 0,05, Abb. 6b). Die KEGG-Datenbank (http://www.genome.jp/kegg/) ist eine häufig genutzte bioinformatische Website zur Genfunktionsanalyse. In dieser Studie wurden insgesamt 11.729 Unigene in 258 bekannten Signalwegen in der KEGG-Datenbank gruppiert. Die Ergebnisse des KEGG-Signalwegs zeigten, dass immunbezogene Signalwege überexprimiert wurden, wie der PI3K-Akt-Signalweg, der MAPK-Signalweg, der Chemokin-Signalweg, die Antigenverarbeitung und -präsentation, der AMPK-Signalweg und der B-Zell-Rezeptor-Signalweg (Abb. 6c). Gene Ontology (GO) ist ein weiteres System zur Genkategorisierung. Den Nachweisergebnissen zufolge wurden 11.729 Unigene klassifiziert und in drei Kategorien eingeteilt: molekulare Funktion, zelluläre Komponente und biologischer Prozess. Diese Unigene wurden weiter in 58 Unterkategorien unterteilt (Zusatzdatei 2: Abb. S9a). Die Analyse der biologischen Prozessanreicherung zeigte, dass die Gene, die mit der Immunantwort in Zusammenhang stehen, eng miteinander verwandt sind (Abb. 6d). In der Kategorie der Zellkomponenten war der Golgi-Apparat das am stärksten exprimierte Unigen (Zusatzdatei 2: Abb. S9b). Innerhalb der Kategorie der molekularen Funktionen waren die fünf am häufigsten vorkommenden Unterkategorien ATP-Bindung, Bindung identischer Proteine, Bindung, Bindung makromolekularer Komplexe und Proteinkinase-Bindung (Zusatzdatei 2: Abb. S9c). Basierend auf der GO-Analyse gehen wir davon aus, dass das piezoelektrische Hydrogel CG/PHA/5 % PBT die Immunantwort auf Basis von Makrophagen regulieren könnte. Die Hauptfunktion des Golgi-Apparats besteht darin, vom endoplasmatischen Retikulum synthetisierte Proteine ​​zu verarbeiten, zu sortieren und zu transportieren und sie dann zu bestimmten Teilen der Zelle zu schicken oder sie außerhalb der Zelle abzusondern. Daher steht die Polarisation von Makrophagen in engem Zusammenhang mit dem Stoffwechsel des Golgi-Apparats. Auf molekularer Ebene umfasst der Prozess der Makrophagenpolarisierung den Energiestoffwechsel und die dynamische Membranbindung.

Transkriptomanalyse der Makrophagenimmunität, reguliert durch das piezoelektrische CG/PHA/5 % PBT-Hydrogel. a Quantitative Analyse von DEGs in Makrophagen aus den Gruppen CG und CG/PHA/5 % PBT. b Heatmap von DEGs, die mit der Immunregulation verbunden sind. A1–A5 sind CG-Hydrogelproben und B1–B5 sind piezoelektrische CG/PHA/5 % PBT-Hydrogelproben. c KEGG-Signalweganalyse in Makrophagen aus den Gruppen CG und CG/PHA/5 % PBT. d GO-Anreicherungsanalyse der 20 am stärksten unterschiedlich hoch- und herunterregulierten biologischen Prozesse. CG-Chitosan/Gelatine, PHA-Polydopamin-beschichtetes Hydroxylapatit, PBT-Polydopamin-beschichtetes Bariumtitanat, DEGs differenziell exprimierte Gene, KEGG-Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome, GO-Genontologie

Den Ergebnissen der RNA-Sequenzierung zufolge könnte der PI3K-Akt-Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Makrophagen-M2-Polarisierung spielen. Da sich phosphorylierte Proteine ​​in einem aktiven Zustand befinden, der die Zellfunktionen reguliert, verwendeten wir Immunhistochemie, um die Spiegel von p-PI3K und p-Akt in regenerierten Knochengeweben zu bestimmen (Zusatzdatei 2: Abb. S10a). Die Ergebnisse zeigten, dass die p-PI3K- und p-Akt-Proteinexpression in der CG/PHA/5 % PBT-Gruppe am höchsten war, gefolgt von den CG/PHA- und CG-Gruppen (P < 0,05). Daraus kann geschlossen werden, dass das piezoelektrische Hydrogel CG/PHA/5 % PBT die PI3K/Akt-Signalachse erheblich aktivieren könnte, um die Polarisation des Makrophagen M2 zu regulieren. Basierend auf den Tierversuchsergebnissen verwendeten wir den PI3K-Inhibitor BEZ235 (0, 10, 100 und 200 ng/ml), um den PI3K/Akt-Signalweg in Makrophagen zu blockieren, die in den piezoelektrischen Hydrogelen inokuliert wurden. Wie in der Zusatzdatei 2: Abb. S10b gezeigt, konnten Makrophagen durch Zugabe von LPS (200 ng/ml) zum Co-Kultursystem aus piezoelektrischen Hydrogelen und Makrophagen auf den M1-Phänotyp umgestellt werden. IL-4, ein entzündungshemmendes Zytokin, könnte die Polarisation von Makrophagen Typ 2 bei einer Konzentration von 20 ng/ml deutlich fördern. Im Gegensatz dazu könnte BEZ235, ein Inhibitor von PI3K, die M2-Polarisierung von Makrophagen signifikant hemmen. Als die Konzentration des Inhibitors BEZ235 auf 0 ng/ml sank, verschwand die Hemmwirkung und die Hydrogele konnten die M2-Polarisierung der Makrophagen fördern. Es wurde berichtet, dass Integrine und CD44 vorgelagerte Elemente des PI3K/Akt-Signalwegs sind, die an der Polarisation von Makrophagen beteiligt sind [41]. Daher wird in Abb. 7 ein hypothetisches Schema des Mechanismus vorgeschlagen, durch den das piezoelektrische Hydrogel aus CG/PHA/5 % PBT die Polarisation des Makrophagen M2 reguliert.

Schematische Darstellung des möglichen molekularen Mechanismus, durch den das piezoelektrische Hydrogel CG/PHA/5 % PBT die Knochenreparatur fördert, indem es die Polarisation des Makrophagen M2 reguliert und die PI3K/Akt-Achse aktiviert. CG-Chitosan/Gelatine, PHA-Polydopamin-beschichtetes Hydroxylapatit, PBT-Polydopamin-beschichtetes Bariumtitanat, PI3K-Phosphoinositol-3-Kinase, Akt-Serin/Threonin-Proteinkinase

In der vorliegenden Studie wurde erfolgreich ein vielseitiges piezoelektrisches CG/PHA/PBT-Hydrogelgerüst für die Knochengewebetechnik konstruiert. Dieses piezoelektrische Hydrogel erzeugt nicht nur spontan Elektrizität, sondern reguliert auch Immunität, Angiogenese und Osteogenese. Wir haben den Mechanismus, der der spontanen Elektrizität dieses piezoelektrischen Hydrogels in Abb. 1c zugrunde liegt, sorgfältig durchdacht, was erklären kann, wie es eine piezoelektrische Mikroumgebung schafft, die der Regeneration in vivo förderlich ist. Der knochenfördernde Effekt der piezoelektrischen Hydrogele wurde durch mehrere In-vitro- und In-vivo-Experimente bestätigt. Darüber hinaus haben wir den Schlüsselsignalweg (PI3K/Akt-Achse) auf molekularer Ebene durch Transkriptomsequenzierung identifiziert. Schließlich kehrten wir zu In-vivo-Experimenten zurück, um die Expressionsänderungen von phosphorylierten PI3K- und Akt-Proteinen zu verifizieren, sowie zu In-vitro-Inhibitionsexperimenten, um ihre regulatorischen Rollen zu bestimmen. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass das energieautarke piezoelektrische CG/PHA/PBT-Hydrogel die M2-Polarisierung des Makrophagen regulieren könnte, indem es eine piezoelektrische Mikroumgebung schafft und so die Angiogenese und Osteogenese und letztendlich die Knochenheilung fördert.

Gel ist ein wasserlösliches Protein, das durch Verarbeitung und Denaturierung von Kollagen entsteht, dem Hauptprotein von Haut, Sehnen, Knochen und anderen Geweben [42]. Gerade aufgrund seiner hervorragenden Löslichkeit weist Kollagen schlechte mechanische Eigenschaften auf, was seinen Einsatz allein im Tissue Engineering schwierig macht. Daher muss Kollagen in der Regel mit anderen Polymeren kombiniert und chemisch vernetzt werden, bevor es im Tissue Engineering eingesetzt werden kann [43]. Cs ist eine Art natürliches kationisches Polysaccharid, das im Allgemeinen durch Deacetylierung des Exoskeletts von Krebstieren und Insekten gewonnen wird [44]. Wenn Cs chemisch mit Gel vernetzt wurde, verbesserten sich die mechanischen Eigenschaften des CG-Hydrogels erheblich [45, 46]. Prokhorov et al. [47] stellten ein piezoelektrisches CS-BT-Polymer her, die In-vitro-Experimente bestätigten die Möglichkeit im Tissue Engineering. Zhang et al. [48] ​​entwickelten CG-basierte Nähte. In-vivo-Experimente zeigten, dass diese CG-basierten Nähte die Entzündungsreaktion reduzieren und die Gewebeintegration aufgrund des synergistischen Effekts der porösen Struktur und der bioaktiven Oberflächenbeschichtung fördern können, was ein großes Potenzial für die Anwendung bei der Sehnenheilung und dem funktionellen Umbau bietet. Park et al. [49] haben einen unkonventionellen viskoelastischen CG-Hydrogel-Dämpfer aus Bandfiltermaterial vorgeschlagen, um dynamisch-mechanische Geräuschartefakte selektiv zu entfernen. Hydrogele weisen frequenzabhängige Phasenübergänge auf, die zu einem Gummizustand führen, der niederfrequentes Rauschen dämpft, und zu einem Glaszustand, der das gewünschte Hochfrequenzsignal überträgt. Die CG-Hydrogele demonstrierten einen adaptiven Passfilter, der hochwertige Signale von Patienten erfasst und gleichzeitig die Signalverarbeitung in der fortschrittlichen Bioelektronik minimiert.

Derzeit konzentrieren sich die meisten Experimente zur Verbesserung der Knochenregeneration hauptsächlich auf die folgenden zwei Aspekte: 1) Förderung der Differenzierung von Osteoblasten und 2) Reduzierung der Anzahl und Aktivität von Osteoklasten. Die aktuelle Mainstream-Forschungsrichtung besteht darin, die Differenzierung von Osteoblasten zu verbessern, beispielsweise durch die Erhöhung der Wachstumsfaktoren, die direkt auf Osteoblasten abzielen, wie z. B. BMP-2 und Runx2 [6, 50, 51, 52, 53]. HA kann die Kombination chemischer Bindungen mit der Knochengewebeschnittstelle realisieren und weist eine gewisse Löslichkeit im menschlichen Körper auf. Die Freisetzung von Ionen kann am Knochenstoffwechsel im Körper beteiligt sein und hat eine stimulierende und induzierende Wirkung auf Knochenhyperplasie oder osteogene Differenzierung. Zahlreiche Zell- und Tierversuche haben gezeigt, dass HA eine überlegene Knochendifferenzierungsaktivität aufweist [54, 55].

BaTiO3-Nanopartikel haben sich im Bereich der biomedizinischen Technik als vielversprechend erwiesen [9, 56, 57]. Kim et al. [58] zeigten, dass BaTiO3 zur Stimulation von tiefem Gehirngewebe verwendet werden kann, indem es Stickstoffmonoxid (NO) produziert und unter Ultraschall elektrischen Strom erzeugt. Die Freisetzung von NO könnte die Blut-Hirn-Schranke vorübergehend durchbrechen und die Ansammlung von BaTiO3-Nanopartikeln im Gehirnparenchym ermöglichen, und der piezoinduzierte Ausgangsstrom regt dopaminerge neuronenähnliche Zellen zur Freisetzung von Dopamin an. Die Anwendung von BaTiO3 kann ohne nennenswerte Toxizität zu einer Linderung der Symptome der Parkinson-Krankheit führen. Liu et al. [59] schlugen ein piezokatalytisches BaTiO3-Hydrogel vor, um die Heilung bakteriell infizierter Wunden zu fördern. Das BaTiO3-Verbundhydrogel verfügt über ein starkes internes elektrisches Feld und erzeugt aufgrund der Anwesenheit von BaTiO3-Nanopartikeln ROS, die hervorragende antibakterielle Wirkungen haben, die zur Heilung infizierter Wunden beitragen. Daher bieten BaTiO3-Nanopartikel aufgrund ihrer hervorragenden piezoelektrischen Eigenschaften große Aussichten für die Anwendung im Bereich der biomedizinischen Technik. Aufgrund der umfassenden Bewertung der Eigenschaften von Cs, Gel, HA und BaTiO3 nutzen wir diesen quartären Komplex für die Forschung zur Knochengeweberegeneration.

Das BaTiO3-Hydrogel in dieser Studie fungierte als Nanogenerator und konnte unter einem Druck von 1 kPa eine Ausgangsspannung von 0,8 V erzeugen. Sun et al. [60] entwickelten einen piezoelektrischen Nanogenerator aus Holzschwamm, der unter einem Druck von 4,4 kPa eine Ausgangsspannung von 0,4 V erzeugte. Darüber hinaus erzeugte eine Reihe von Cs-Nanogeneratoren gerade eine Ausgangsspannung von 0,06 V [61]. Daher weist unser BaTiO3-Hydrogel-Nanogenerator eine hervorragende Eigenleistung auf. In der Militärmedizin könnte das piezoelektrische Hydrogel nicht nur als Gerüst für die Knochengewebetechnik verwendet werden, sondern würde aufgrund der autarken Eigenschaft des piezoelektrischen Hydrogels auch als Biosensor und Energiespeichergerät fungieren [62, 63].

Die Reparatur nach einer Knochenverletzung umfasst mehrere biologische Reaktionsstufen: 1) Im frühen Stadium der Entzündungsreaktion können traumabedingte Signale Immunzellen aktivieren, was zu Veränderungen im chemischen Gradienten von Entzündungsfaktoren und der Rekrutierung von mehr Immunzellen an der Stelle führt einer Knochenverletzung, wodurch die Immunantwort ausgelöst wird; 2) Chronische Entzündung: 3–5 Tage nach der Verletzung können nekrotisches Gewebe und Bakterien durch eine akute Entzündung entfernt werden, und die Knochendefektstelle tritt dann in ein chronisches Entzündungsstadium ein. In diesem Stadium polarisieren die Makrophagen an der Defektstelle allmählich in Richtung des M2-Phänotyps (entzündungshemmender Typ) und der Körper induziert durch Immunregulierung und Rekrutierung Stammzellen, sich in verschiedene funktionelle Zellen zu differenzieren, was die Produktion von neuem Knochengewebe fördert [64]. , 65]. Die entzündliche Mikroumgebung kann durch die Sekretion regenerativer Zytokine wie Runx2 und TGF-β in eine Reparatur-Mikroumgebung umgewandelt werden [66]. Daher ist die Förderung der Polarisierung von Makrophagen zum M2-Typ bei der Knochenreparatur ein dringendes Problem, das bei der Knochenregeneration angegangen werden muss. Viele Berichte haben gezeigt, dass die endogene elektrische Mikroumgebung des primären Knochengewebes durch die Herstellung piezoelektrischer Verbundmaterialien reproduziert werden kann [9, 15, 67]. Als das piezoelektrische CG/PHA/PBT-Hydrogel auf die Makrophagen aufgetragen wurde, wandelten sich die Makrophagen in den M2-Phänotyp um.

Darüber hinaus haben wir durch Transkriptionstests die wichtigsten Signalwege untersucht, über die das piezoelektrische Hydrogel die Makrophagenpolarisierung reguliert. Die Inhibitionstests konnten bestätigen, dass CG/PHA/PBT-Hydrogele die PI3K/Akt-Phosphorylierung hochregulieren, um die Polarisation des Makrophagen M2 zu regulieren. Im schematischen Diagramm von Abb. 7 haben wir den Mechanismus des piezoelektrischen Hydrogels anhand von In-vitro- und In-vivo-Experimenten zusammengefasst. Die piezoelektrische Mikroumgebung und die durch das piezoelektrische Hydrogel verursachte Stimulation wirken auf die Makrophagen-Oberflächenrezeptoren und führen dann zur Aktivierung des nachgeschalteten Signalwegs, um die positive Regenerations-Mikroumgebung zu regulieren. Liu et al. [68] gaben an, dass Integrin β1 ein vorgeschaltetes Signalmolekül von PI3K/Akt ist und dass die von ihnen entwickelten biologischen Gerüstmaterialien die Polarisation von Makrophagen durch die Aktivierung von Integrin β1-Makrophagenoberflächenrezeptoren regulieren können, um den PI3K/Akt-Signalweg zu aktivieren. Duan et al. [41] fanden heraus, dass CD44 und Rho-assoziierte Proteinkinase (ROCK) vorgelagerte Moleküle von PI3K/Akt sind, während das Säugetierziel von Rapamycin (mTOR) das nachgeschaltete Protein von PI3K/Akt ist, das die Polarisation von Makrophagen reguliert. In Kombination mit unseren Ergebnissen zeigen diese Ergebnisse die Bedeutung des PI3K/Akt-Signalwegs für die Makrophagenpolarisierung. Darüber hinaus haben Ma et al. [69] gaben an, dass der Toll-like-Rezeptor (TLR)-Signalweg über die modulare Analyse und die funktionelle Anreicherungsanalyse an der Regulierung der Makrophagenpolarisierung beteiligt ist. Darüber hinaus kann die Aktivierung des Notch-Signals die Differenzierung von Makrophagen in M1 regulieren und eine Rolle bei der Förderung von Entzündungen und Antitumoraktivität spielen [70]. Diese Ergebnisse und einige andere Berichte liefern uns wichtige Proteinziele für die Entwicklung von Gerüsten und Medikamenten zur Förderung der Knochengeweberegeneration. Darüber hinaus haben wir dieses piezoelektrische Hydrogel in dieser Forschung nur zur Knochenreparatur eingesetzt und werden die Anwendung dieser Art von piezoelektrischem Hydrogel in zukünftigen Studien auf die Forschung im Nerven-, Bänder-, Muskel- und Hautgewebe-Engineering ausweiten.

In dieser Studie haben wir ein vielseitiges poröses piezoelektrisches Hydrogel entworfen und synthetisiert, das über gute immunregulatorische, angiogene und osteogene Funktionen verfügt und schnell die Bildung neuer Knochen bewirken kann. Wir haben PHA- und PBT-Nanopartikel in das Hydrogel eingebracht, die nicht nur die physikalischen und chemischen Eigenschaften und die Biokompatibilität des Hydrogels verbessern, sondern auch die osteogene Aktivität fördern können. Dieses Hydrogel-Gerüst kann die Adhäsion, Proliferation und Osteogenese von Osteoblasten (MC3T3-E1) erheblich fördern. Da das piezoelektrische Hydrogel kontinuierlich eine endogene elektrische Stimulation erzeugen kann, hat es entsprechende immunmodulatorische Wirkungen, die synergistisch die Knochenregeneration und den Wiederaufbau des Gefäßnetzwerks fördern können. Mehrere Experimente bestätigten, dass das vielseitige piezoelektrische Hydrogel eine heilungsfördernde Immunnische schuf. An der mit piezoelektrischem Hydrogel behandelten Knochendefektstelle wurden viele entzündungshemmende Makrophagen (M2-Phänotyp) und wenige proinflammatorische Makrophagen (M1-Phänotyp) beobachtet. Das piezoelektrische CG/PHA/PBT-Hydrogel aktiviert die PI3K/Akt-Signalachse, um die Polarisation des Makrophagen M2 zu regulieren. Daher haben wir in dieser Studie detailliert die Fähigkeit des Hydrogels untersucht, die Polarisierung des M2-Makrophagen-Phänotyps zu fördern, die osteogene Differenzierung und Angiogenese zu verbessern und die Knochenregeneration und -umgestaltung zu beschleunigen. Das vorbereitete piezoelektrische Hydrogelimplantat ist eine Art potenzielles bioaktives Gerüstbiomaterial mit der besonderen Fähigkeit, eine piezoelektrische Mikroumgebung zu erzeugen. Diesen Beobachtungen zufolge zeigt das piezoelektrische Hydrogel-Knochengewebegerüst aus CG/PHA/PBT Potenzial als Knochentransplantationsschema für die klinische Anwendung bei der Reparatur großer Knochendefekte.

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Wechselstrom

Alkalische Phosphatase

Alizarinrot

Bariumtitanat

Knochenmorphogenetisches Protein 2

Chitosan

Komplementäre DNA

Kollagen Typ I

Ethylendiamintetraessigsäure

Gelatine

Menschliche Endothelzellen der Nabelschnurvene

Hydroxylapatit

Hämatoxylin und Eosin

Induzierbare Stickoxid-Synthase

Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome

Mesenchymale Stammzellen

Osteopontin

Osteocalcin

Polydopamin

Polydopaminmodifiziertes keramisches Hydroxylapatit

Reaktive Sauerstoffspezies

Runt-bezogener Transkriptionsfaktor 2

Toll-like-Rezeptor

Transmissionselektronenmikroskopie

Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor

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Unzutreffend.

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82202352, 82271629), dem Translational Medicine and Interdisciplinary Research Joint Fund des Zhongnan Hospital der Wuhan University (ZNLH202202), dem China Postdoctoral Science Foundation Funded Project (2023M732711) und der Wenzhou unterstützt Stipendium der Medizinischen Universität (QTJ23004).

Ping Wu, Lin Shen, Hui-Fan Liu und Xiang-Hui Zou haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Schlüssellabor für bildgebende Diagnose und minimalinvasive Interventionsforschung, das fünfte angegliederte Krankenhaus der Wenzhou Medical University, Lishui, 323000, Zhejiang, China

Ping Wu, Lin Shen, Juan Zhao, Yu Huang und Zhou-Guang Wang

Oujiang Laboratory (Zhejiang Lab for Regenerative Medicine, Vision and Brain Health), School of Pharmaceutical Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325000, Zhejiang, China

Ping Wu, Xiao-Kun Li und Zhou-Guang Wang

Abteilung für Wirbelsäulenchirurgie und Muskel-Skelett-Tumor, Zhongnan-Krankenhaus der Wuhan-Universität, Wuhan, 430071, China

Hui-Fan Liu, Yu-Fan Zhu, Min-Hao Wu und Lin Cai

National Engineering Research Center for Nanomedicine, College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430074, China

Xiang-Hui Zou, Chao Xu und Zhi-Qiang Luo

Department of Overseas Education College, Jimei University, Xiamen, 361021, Fujian, China

Zhao-Yu Li

Schule und Krankenhaus für Stomatologie, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035, Zhejiang, China

Li-Hua Luo

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PW, MHW und ZGW haben das gesamte Projekt entworfen und das Manuskript geschrieben. PW, HFL und MHW führten die meisten Experimente durch. XHZ führte den piezoelektrischen Test durch. JZ, YH, CX und LHL führten die Tierversuche durch. YFZ zeichnete die Schaltpläne. LS, ZYL, ZQL, LC und XKL waren für die Bearbeitung und Überarbeitung des Manuskripts verantwortlich. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Min-Hao Wu, Lin Cai, Xiao-Kun Li oder Zhou-Guang Wang.

Die Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee des Zhongnan Hospital der Universität Wuhan genehmigt (Nr. ZN2022282).

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel beschriebene Arbeit beeinflussen könnten.

Die Primersequenzen jedes Gens.

Ablaufdiagramm von Tierversuchen und entsprechenden Tests. Abb. S2 Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Bilder von Bariumtitanat-Nanopartikeln. Abb. S3 Analyse eines piezoelektrischen Hydrogels, das die Makrophagenpolarisierung fördert. Abb. S4: Fördernde Zytokinsekretion in Makrophagen, stimuliert durch piezoelektrische Hydrogele. Abb. S5 Repräsentative quantitative Analyse der Migrationsfähigkeit von HUVEC-Zellen im Transwell- (a) und Wundheilungsmigrations-Assay (b) für Abb. 4b-c. Abb. S6 In-vitro-Bewertung der osteogenen Aktivität. Abb. S7 In-vivo-Bewertung der Immunregulation; Angiogenese und Osteogenese nach piezoelektrischer Hydrogelimplantation. Abb. S8 Repräsentative immunhistochemische Färbungsbilder von Col-1, Runx2, OPN, CD31 und CD34 im Defektbereich 8 Wochen nach der Implantation. Abb. S9 Ergebnisse der Transkriptomsequenzierung von Makrophagen unter der piezoelektrischen Hydrogelstimulation. Abb. S10 Das piezoelektrische Hydrogel CG/PHA/5 % PBT reguliert die Knochenreparatur über die PI3K/Akt-Achse.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Wu, P., Shen, L., Liu, HF. et al. Die Verbindung immunmodulatorischer, angiogener und osteogener Fähigkeiten in einem piezoelektrischen Hydrogel-Gewebe-Engineering-Gerüst für die Militärmedizin. Military Med Res 10, 35 (2023). https://doi.org/10.1186/s40779-023-00469-5

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Eingegangen: 4. April 2023

Angenommen: 05. Juli 2023

Veröffentlicht: 31. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s40779-023-00469-5

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