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Jul 19, 2023

Quercetin hemmt die Proliferation von Toxoplasma gondii-Tachyzoiten und wirkt synergistisch mit Azithromycin

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 261 (2023) Diesen Artikel zitieren 39 Zugriffe Metrikdetails Quercetin (QUE) ist ein natürliches Polyphenol, das bekanntermaßen zahlreiche pharmakologische Eigenschaften hat

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Quercetin (QUE) ist ein natürliches Polyphenol, von dem bekannt ist, dass es zahlreiche pharmakologische Eigenschaften gegen infektiöse und nichtinfektiöse Krankheiten besitzt. Azithromycin (AZ) ist ein Antibiotikum, das zur Azalid-Klasse der antimikrobiellen Mittel gehört und ein Antiparasitikum ist, das in Kombination mit Clindamycin bekanntermaßen im klinischen Umfeld gegen Pyrimethamin/Sulfadiazin-resistente Toxoplasma gondii-Tachyzoiten wirksam ist. Von beiden Verbindungen ist bekannt, dass sie auf die Proteinsynthese abzielen und entzündungshemmende Eigenschaften haben. Über die synergistische Wechselwirkung von QUE und AZ gegen das Wachstum von T. gondii ist jedoch wenig bekannt. Hier berichten wir zum ersten Mal über die Auswirkungen der Kombination von QUE und AZ auf das Wachstum von T. gondii. Die 50-prozentige Hemmkonzentration (IC50) für QUE nach 72 Stunden Interaktion mit Parasiten wurde mit 0,50 µM ermittelt, wohingegen AZ nach 72 Stunden Interaktion mit Parasiten einen IC50-Wert von 0,66 µM ergab. Kombinationstests von QUE und AZ im Verhältnis 2:1 (QUE:AZ) ergaben einen IC50-Wert von 0,081 µM. Interessanterweise wurde ein fraktioneller Hemmindexwert von 0,28 beobachtet, was auf eine starke Synergie hinweist. Es wurde auch festgestellt, dass QUE die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies hochreguliert und eine Funktionsstörung der Mitochondrienmembran sowohl intrazellulärer als auch extrazellulärer T. gondii-Tachyzoiten verursacht. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass QUE eine neuartige Leitstruktur ist, die mit AZ synergistisch wirken kann, um das Wachstum von T. gondii zu hemmen, und möglicherweise eine zukünftige In-vivo-Untersuchung für die mögliche Entwicklung von Kombinationsmedikamenten wert ist.

Toxoplasmose ist eine weltweit vernachlässigte parasitäre Erkrankung, die durch den obligat intrazellulären Protozoenparasiten Toxoplasma gondii verursacht wird. Es ist bekannt, dass die Krankheit sowohl warm- als auch kaltblütige Wirtszellen befällt [1,2,3] und es wurde berichtet, dass mehr als ein Drittel der Weltbevölkerung mit T. gondii infiziert ist [1, 3], einschließlich etwa 40 Millionen Menschen in den USA [4]. Besorgniserregend ist auch, dass es weltweit etwa 1,20 Millionen Fälle von angeborener Toxoplasmose gibt [5], wobei in den USA jährlich etwa 400 bis 4000 Fälle gemeldet werden [4]. Die Zahl könnte höher sein, da nicht alle US-Bundesstaaten T. gondii-Seroprävalenztests bei schwangeren Frauen durchführen. Tatsächlich führen nur wenige Bundesstaaten wie Massachusetts und New Hampshire bei vorgeburtlichen Besuchen ein Screening auf angeborene Toxoplasmose durch [6, 7].

Eine Infektion mit Toxoplasma gondii verläuft bei den meisten immunkompetenten Personen klinisch asymptomatisch. Allerdings zeigen immungeschwächte Menschen (z. B. HIV-infizierte Patienten, Krebspatienten, Patienten mit Organtransplantationen und solche, die Bluttransfusionen erhalten) klinische Symptome, die von leicht bis lebensbedrohlich reichen können [4, 8, 9].

Toxoplasma gondii wird durch die Aufnahme von Gewebezysten in rohem oder ungekochtem Fleisch, kontaminierten Böden, Wasser und kontaminierten Lebensmitteln erworben [2]. Die beiden Erstlinienbehandlungen für eine T. gondii-Infektion beim Menschen sind eine Kombinationstherapie mit Sulfadiazin (SDZ) und Pyrimethamin (PYR) und eine Kombinationstherapie mit Trimethoprim und Sulfamethoxazol [10, 11]. Diese Medikamente sind jedoch mit schwerwiegenden gesundheitsschädlichen Auswirkungen verbunden, wie der Auslösung von Leukopenie, Neutropenie, Überempfindlichkeitsreaktionen, Thrombozytopenie, Knochenmarkssuppression und Megaloblastenanämie bei Patienten mit stark niedriger Thrombozytenzahl [10,11,12,13,14]. ,15,16,17,18]. Diese Herausforderungen erfordern mehr Forschung zur Suche nach neuen Anti-T. gondii-Inhibitoren gegen Toxoplasmose, die als Einzeltherapie oder in Kombination mit anderen Medikamenten wirken können.

Azithromycin (AZ) ist ein Makrolid-Antibiotikum, das ein Derivat von Erythromycin ist und das umfassend erforscht wurde und sich als wirksames Anti-Toxoplasma-Mittel im Falle eines Behandlungsversagens mit der Pyrimethamin/Sulfadiazin-Kombination erwiesen hat. Dieses Antibiotikum ähnelt strukturell Erythromycin, weist starke antibakterielle Eigenschaften und ein wünschenswertes pharmakokinetisches Profil auf. Es wurde gezeigt, dass AZ die Translation im normalerweise translatorisch aktiven plasmodialen Apikoplasten blockiert und daher allgemein zur Behandlung von Lungenentzündung und Chlamydien, insbesondere bei schwangeren Frauen, eingesetzt wird [18]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass AZ die T. gondii-Infektion in menschlichen Zottenexplantaten kontrolliert [19].

Quercetin (QUE) ist ein polyphenolisches Flavonoid, das in den meisten pflanzlichen Lebensmitteln, Kräuterzusätzen, Gemüse, Obst, Tee, Rotweinen und Samen vorkommt. Es enthält ein breites Spektrum an biologischen Eigenschaften, die schützende Eigenschaften haben, wie z. B. entzündungshemmende [20, 21], antimutagene [22], krebshemmende [23] und antioxidative [24] Wirkungen sowie inhärente antibakterielle Eigenschaften gegen Escherichia coli [25] und die Verringerung oder Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen [26]. Frühere Studien haben gezeigt, dass QUE bei der Abtötung von Staphylococcus epidermidis [27] sowie mit anderen Antibiotika wie Levofloxacin, Ceftriaxon, Gentamycin, Tobramycin und Amikacin gegen Pseudomonas aeruginosa [28] und mit Epigallocatechingallat gegen Leishmania synergistisch wirkt [29]. Über die Wechselwirkung von QUE mit AZ gegen das Wachstum von T. gondii ist jedoch wenig bekannt.

In der vorliegenden Studie haben wir QUE allein und seine Kombination mit AZ getestet, um die Hypothese zu testen, ob sich Synergien ergeben würden.

Vero-Zellen (eine Linie, die ursprünglich aus Nierenepithelzellen einer afrikanischen Grünen Meerkatze isoliert wurde), die Glühwürmchen-Luciferase (Luc2p) exprimieren, wurden vom NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository (BEI Resources, Manassas, VA, USA; NAID; NIH; NR) erhalten -10385). Der virulente Stamm RH-(YFP)2 von Toxoplasma gondii Typ I, der das gelb fluoreszierende Protein (YFP)2 exprimiert, wurde freundlicherweise von Prof. William H. Witola (College of Veterinary Medicine, University of Illinois, Urbana Champaign, IL, USA) zur Verfügung gestellt. Vero-Zellen wurden in einem T-25-cm3-Kolben gezüchtet, der Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) enthielt, ergänzt mit 1 % Penicillin-Streptomycin (PS) und Amphotericin B-Lösung als Antibiotika ( Gibco, Thermo Fisher Scientific) und 10 % fötales Rinderserum (FBS) (Life Technologies Inc., Thermo Fisher Scientific. Die Kulturen wurden bei 37 °C mit 5 % CO2 gehalten, um konfluent zu werden. Toxoplasma gondii Tachyzoiten virulenter Stämme vom RH-Wild-Typ ( WT) ohne Fluoreszenzmarkierung und hTERT-Zellen (Fibroblasten) wurden von Prof. Silvia NJ Moreno (University of Georgia, Athens, GA, USA) bereitgestellt.

Vero-Zellen (6 × 104 Zellen/200 µl) wurden in schwarze 96-Well-Platten ausgesät und 24 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Vero-Zellen gewaschen, um tote Zellen zu entfernen, und den Zellen wurden 100 µl Wachstumsmedium zugesetzt. QUE und AZ wurden in einem 100-µl-Volumen in Konzentrationen von 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 bzw. 0 µM zugegeben und 48 Stunden lang inkubiert. Nach 48 Stunden wurden 10 µl Alamar-Blau-Farbstoff (Abcam, Waltham, MA, USA) in die Kulturvertiefungen gegeben, und die Platten wurden mit Aluminiumfolie abgedeckt und bei Standardkulturbedingungen inkubiert. Die Fluoreszenz wurde bei 560/630 nm mit dem unendlichen Fluoreszenzplattenlesegerät Tecan 200F (Tecan Group, Männedorf, Schweiz) gemessen. Die Experimente wurden in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt und die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) (n = 3) dargestellt.

QUE und AZ wurden von Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX, USA) erhalten und in Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt. Es wurden die T. gondii RH-(YFP)2-Tachyzoiten verwendet, die in der gesamten Kultur gelb fluoreszierendes Protein (YFP)2 exprimieren um die hemmende Wirkung von QUE allein und in Kombination mit AZ auf T. gondii-Parasiten in vitro zu testen. Vero-Zellen (6,0 × 104 Zellen/(200 µl)) wurden in 96-Well-Platten ausgesät und bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert für 24 Stunden für 90 % Konfluenz, anschließend wurden genau 100 µl frisch gereinigte Tachyzoiten in einer Konzentration von 1 × 104 Parasiten/Vertiefung zu den Vero-Zellen gegeben. Die experimentelle Verbindung QUE und das Standardarzneimittel (AZ) wurden in einem Volumen zugegeben von 100 µl bei den Konzentrationen 0, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5 bzw. 25 µM und inkubiert bei 37 °C mit 5 % CO2. Das Toxoplasma gondii-Wachstum bei 72 Kulturen wurde mit einem unbegrenzten Fluoreszenzplattenlesegerät Tecan 200 F mit Anregung gemessen eingestellt auf 485 nm und die Emission auf 535 nm (Tecan Group). Die Fluoreszenzintensitäten wurden unter Verwendung der in [30] angegebenen Formel in prozentuale Hemmung umgerechnet. Die Konzentrationen der Verbindung QUE und AZ wurden gegen die prozentuale Hemmung des T. gondii-Wachstums mit der GraphPad Prism-Software 9.2 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) aufgetragen. Die Experimente wurden in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt und die Ergebnisse als Mittelwert ± dargestellt SD (n = 3).

72 Stunden nach der Behandlung mit QUE und AZ wurden die Platten dreimal mit 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, um alle Verbindungen und alle extrazellulären Parasiten zu entfernen. Nach dem Waschen wurden 100 µl mit 10 % FBS ergänztes DMEM in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von der ersten Ablesung am Tag 0. Die Intensität der Parasitenfluoreszenz wurde für die folgenden 72 Stunden aufgezeichnet und die 50 % wirksamen Mindestkonzentrationen wurden nach 72 Stunden bestimmt Stellen Sie fest, ob die entfernten Verbindungen immer noch Auswirkungen auf das Tachyzoitenwachstum hatten. Die Negativkontrollvertiefungen (denen zuvor keine Medikamente zugesetzt wurden) dienten als 100 %-Benchmark und die Nachbehandlung mit QUE- und AZ-Entzug diente als Versuchsvertiefungen. Die IC50s-Werte wurden wie oben im individuellen Wachstumshemmungstest ermittelt. Die Experimente wurden in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt und die Ergebnisse als Mittelwert ± SD von Dreifachversuchen (n = 3) dargestellt.

Vero-Zellen (6,0 × 104 Zellen/200 µl) wurden für 24 Stunden in 96-Well-Platten ausgesät, wie oben für die Prüfung einzelner Verbindungen beschrieben, gefolgt von der Reinigung von RH-(YFP)2-Tachyzoiten wie oben beschrieben. Die in den einzelnen oben beschriebenen Studien verwendete Parasitenkonzentration wurde in einem Volumen von 100 µl zugegeben, gefolgt von der Zugabe von Arzneimitteln im Verhältnis 1:1 (50 µM QUE: 50 µM AZ), 2:1 (50 µM QUE). : 25 µM AZ) und 1:2 (25 µM QUE: 50 µM AZ), seriell verdünnt, und das Parasitenwachstum wurde mit dem unendlichen Fluoreszenzplattenlesegerät Tecan 200F (Tecan Group) überwacht, wobei die Filter auf 458 nm/535 nm eingestellt waren Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen. Das Parasitenwachstum wurde 72 Stunden lang überwacht und die IC50-Werte wurden aus den Interaktionsdaten nach 72 Stunden mit der GraphPad-Prisma-Software Version 9.2.0 (GraphPad-Software) berechnet. Die Experimente wurden in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt und die Ergebnisse als Mittelwert ± SD von Dreifachversuchen (n = 3) dargestellt. Um die Kombination zu entschlüsseln, die Synergie und Suchtpotenzial für zukünftige Modifikationen entfalten könnte, verwendeten wir die fraktionierte Hemmkonzentration (FICI). Synergie wurde als ein Hemmungs-IC50 definiert, der durch eine Kombination von Verbindungen (QUE-AZ) erzeugt wird und größer ist als die Summe der Hemmkonzentrationseffekte, die durch QUE oder AZ allein hervorgerufen werden. Die FICI-Werte wurden anhand der in [31,32,33] angegebenen Formel bestimmt: FICI = IC50p von QUE in Kombination (QUE-AZ [1:1, 1:2 oder 2:1]/IC50p von QUE allein + IC50p von AZ in Kombination (QUE-AZ [1:1, 1:2 und 2:1])/IC50p von AZ allein. Wir haben eine Standardrichtlinie verwendet, die besagt, dass FICI-Werte < 0,5 als synergistisch gelten; FICI-Werte ≥ 1 zeigen an Additive und FICI-Werte ≥ 2 deuten auf eine antagonistische Wechselwirkung hin [31].

Es wurde bereits berichtet, dass QUE die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in Leishmania amazonensis induziert. Um zu überprüfen, ob QUE einen Einfluss auf die ROS-Produktion in T. gondii-Tachyzoiten hatte, verwendeten wir ein ähnliches Verfahren wie in einer früheren Studie [30] mit Modifikationen. WT T. gondii-Tachyzoiten von Silvia NJ Moreno (University of Georgia, Athens, GA, USA) wurden in Wachstumsmedien ohne Phenolrot in intakten Zellen gehalten. Wir haben frisch lysierte Parasiten vom Typ RH-Wild (RH-W) geerntet, indem wir sie durch eine 27-Gauge-Nadel geleitet und anschließend durch einen 3-µm-Filter filtriert haben. RH-W-Parasiten (1,60 × 106 Parasiten/50 µl pro Vertiefung) wurden in schwarze Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät und entweder mit H2O2 (500 µM) als Positivkontrolle [34] oder mit QUE in unterschiedlichen Konzentrationen (0,66 und 12,5 µM) behandelt ), für 30 Min. bei 37 °C mit 5 % CO2. Nach einer 30-minütigen Inkubation wurde ROS-Farbstoff (Abcam) zugegeben und die Vertiefungen weitere 45 Minuten gemäß dem Protokoll des Herstellers und früheren Arbeiten inkubiert [35]. Die Fluoreszenzintensitäten der Vertiefungen wurden bei einer Anregung von 485 nm bzw. einer Emission bei 563 nm mit dem Tecan 200F Infinite Microplate Reader (Tecan Group) gemessen. Die Experimente wurden in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt und die Ergebnisse als Mittelwert ± SD von Dreifachversuchen (n = 3) dargestellt.

Für Messungen des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) verwendeten wir den kationischen JC-1-Farbstoff als Fluoreszenzsonde (Abcam), wie zuvor beschrieben [30, 36]. Dieses Membranpotential-Kit wurde mit Modifikationen häufig bei In-vitro-Tests des Mitochondrienmembranpotentials von T. gondii-Tachyzoiten eingesetzt [35, 37, 38, 39, 40]. Wir haben sowohl das intrazelluläre als auch das extrazelluläre ΔΨm des Parasiten gemessen. Für den intrazellulären Test wurden 6 × 104 Vero-Zellen in Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte mit klarem Boden (Costar, Corning Inc., Corning, NY, USA) ausgesät, bis sie konfluent waren. Dann wurden 6 × 104 Tachyzoiten von T. gondii RH-WT-Stämmen hinzugefügt. Im Gegensatz dazu wurden im Assay für extrazelluläre Parasiten 1 × 105 frisch gereinigte Parasiten in 100 μl Medium direkt in die Vertiefungen ausgesät (keine Wirtszellen). Dann entweder 100 μl Lösung mit 0,625 und 16,67 μM QUE als experimentelles Arzneimittel, 50 μM Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon (CCCP; Alfa Aesar, Haverhill, MA, USA) als Positivkontrolle oder 1 × HBSS (Assay). Puffer) wurde die Negativkontrolle in die dafür vorgesehenen Vertiefungen gegeben und 8 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert [30, 36]. Ein 10-μl-Aliquot von JC-1 wurde in die Vertiefungen gegeben, die Platten wurden mit Aluminiumfolie abgedeckt und 45 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden die Lösungen entnommen und 5 Minuten lang bei 12 °C und 2000 U/min zentrifugiert und der Überstand entfernt. Als nächstes wurden 100 μl Testpuffer in jede Vertiefung gegeben und erneut unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Parasitenpellets wurden in Lösung mit 100 μl Testpuffer für den extrazellulären Test resuspendiert. Für den intrazellulären Test wurde der Überstand verworfen und anschließend 100 μl Testpuffer hinzugefügt. Sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Parasitentests wurden mit einem EVOS FL-Fluoreszenzmikroskop (Invitrogen Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) abgebildet. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt (n = 3) [36].

Um die Ergebnisse unseres Mitochondrien-Assays weiter zu validieren, verwendeten wir ein modifiziertes Protokoll [30, 37, 39]. Frische extrazelluläre RH-RFP-Parasiten (2,84 × 104) wurden in einem Vollmedium mit QUE in Konzentrationen von 0,62 und 16,67 µM, in Vollmedium ohne Arzneimittel (Medium nur mit Parasiten als Negativkontrolle) oder in Medium mit 500 µM H2O2 inkubiert eine Negativkontrolle. Nach 8-stündiger Inkubation unter den Standardkulturbedingungen von 5 % CO2 bei 37 °C wurde das ATP Detection Assay Kit – Lumineszenz (Katalog-Nr. 700410; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) zur Messung der Lumineszenz von Proben verwendet . QUE (das mit Arzneimittel behandelte Mittel), die Positivkontrolle (H2O2) und die Negativkontrolle (Medium mit Parasiten ohne Arzneimittel) wurden zweimal mit PBS gewaschen und die Pellets auf Eis mit 100 µl Lysepuffer lysiert. Als nächstes wurden 10 µl der Parasitenlysate zu 100 µl Adenosintriphosphat (ATP)-Nachweis-Arbeitslösung in die Vertiefung jeder undurchsichtigen Mikrotiterplatte (Corning) gegeben. Die Platten wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gemäß dem Protokoll des ATP Detection Assay Kit inkubiert, die Abdeckungen der Platten wurden entfernt und die Lumineszenz wurde mit dem Multimode-Mikroplattenlesegerät BioTek Cytation Cell Imaging mit der Software Gen 5.3.1 gemessen ( Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). Die Wirkung von Behandlungen auf die ATP-Lumineszenz von T. gondii wurde mit der ATP-Lumineszenz einer unbehandelten T. gondii-Population (Medium mit Parasiten ohne experimentelle Medikamente oder Negativkontrollen) verglichen und als Prozentsätze dieser Kontroll-ATP-Werte ausgedrückt. Die Experimente wurden in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt und die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachversuchen dargestellt.

Zur Bestimmung der IC50-Werte wurde die GraphPad Prism-Software (GraphPad Software) verwendet. Zur Unterscheidung etwaiger statistischer Unterschiede wurde eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) verwendet. Als Signifikanz wurde ein p-Wert von 0,05 angenommen.

Die IC50-Werte für QUE und AZ gegen T. gondii-Tachyzoitenwachstum nach 72 Stunden wurden mit 0,50 µM bzw. 0,66 µM bestimmt (Tabelle 1).

Die Wachstumskurven des Parasiten als prozentuale Wachstumshemmung in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von AZ bzw. QUE sind in Abb. 1a, b dargestellt. Interessanterweise sind die IC50s-Werte in unserer aktuellen Studie für beide einzelnen Verbindungen vergleichsweise ähnlich denen, die für die derzeit verwendeten Medikamente PYR und SDZ typisch sind, die unter Verwendung von HFF-Zellen berichtet wurden (0,95–1,55 µM für SDZ und 2,42–3,52 µM für PRY [30]; 1,17). ± 0,076 für PRY [41]); 0,79–1,5 µM für PYR [42]; 3,4 µM für PYR [32]; 0,8 µM für PYR [43]; 0,16 µM für PYR [44]).

Wachstumshemmungskurven von Toxoplasma gondii nach 72 Stunden in Gegenwart von Quercetin (a) und Azithromycin (b) bei Konzentrationen von 0, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5 und 25 µM, Wechselwirkung. Die Daten werden als Mittelwerte (ausgefüllte Kreise) von drei unabhängigen Experimenten dargestellt, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden, mit dem Standardfehler des Mittelwerts (Whisker).

Eine kombinierte Behandlung mit QUE und AZ wurde durchgeführt, um festzustellen, ob diese Medikamente in vitro gegen das Wachstum von T. gondii wirken können. Wir stellten fest, dass die kombinierte Behandlung mit QUE und ZA im Verhältnis 2:1 (QUE: AZ) 72 Stunden nach Behandlungsbeginn eine starke Synergie zeigte. Die IC50s-Werte für die kombinierte Behandlung mit QUE und ZA im Verhältnis 2:1 (QUE: AZ), 1:2 (QUE: AZ) und 1:1 (QUE: AZ) wurden zu 0,89, 1,50 bestimmt bzw. 0,081 µM (Tabelle 1). Die fraktionellen Hemmkonzentrationen wurden mit 0,28 berechnet. Das Verhältnis von 2:1 (QUE:AZ) war basierend auf dem berechneten FICI stark synergistisch (Tabelle 1). Allerdings führte die kombinierte Behandlung mit QUE und AZ im Verhältnis 1:2 (QUE:AZ) und 1:1 (QUE:AZ) zu antagonistischen Wechselwirkungen. Die Wachstumskurve für das 2:1-Verhältnis von QUE:AZ ist in Abb. 2 dargestellt.

In-vitro-Hemmungskurve des T. gondii-Stammes RH-(YFP)2 nach 72 Stunden in Gegenwart von kombiniertem Quercetin (QUE) und Azithromycin (AZ) im Verhältnis 2:1 (QUE: AZ) (50 µM QUE: 25). µM AZ). Die getesteten Konzentrationen betrugen 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 und 0 µM für QUE und 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 und µM für AZ. Die Daten werden als Mittelwerte (ausgefüllte Kreise) von drei unabhängigen Experimenten dargestellt, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden, mit dem Standardfehler des Mittelwerts (Whisker). Fragen und Antworten (2.1), Quercetin: Azithromycin im Verhältnis 2:1

Die 50 % zytotoxischen Konzentrationen (CC50) wurden zu 14,98 µM für QUE, 2575 µM für AZ, 60,82 µM für QUE+AZ (2:1), 47,17 µM für QUE+AZ (1:2) und 37,22 µM für QUE berechnet +AZ (1:1) (Tabelle 1). Die Selektivitätsindizes (SI) für QUE, AZ und QUE+AZ (2:1) wurden berechnet und sind in Tabelle 1 dargestellt. Die SI-Werte für die Verhältnisse 1:1, 1:2 und 2:1 von QUE+AZ Die Kombinationen wurden mit 31, 42 bzw. 760,25 berechnet. Alle einzelnen getesteten Verbindungen und Verhältnisse hatten im Vergleich zu einigen der derzeit im klinischen Umfeld zur Behandlung von T. gondii-Infektionen eingesetzten Arzneimittel eine breitbandige Hemmwirkung auf das Parasitenwachstum in vitro.

Um herauszufinden, ob das Absetzen von QUE nach 72-stündiger Behandlung einen Einfluss auf das weitere Wachstum von Tachyzoiten während der ersten 72 Stunden nach dem Absetzen des Arzneimittels hatte, haben wir die Kurven für die Parasitenhemmung bestimmt (Abb. 3a, b). Es wurde festgestellt, dass der Entzug der Verbindung ihre hemmende Wirkung auf das Parasitenwachstum im Vergleich zum nach 72 Stunden getesteten Standardarzneimittel (AZ) nicht aufhob (Tabelle 2). Die IC50s-Werte wurden zu 0,49 bzw. 0,20 µM für QUE und AZ nach 72 Stunden berechnet (Tabelle 2).

Toxoplasma gondii-Hemmungskurven für Parasiten, die nach dem Absetzen des Arzneimittels zunächst 72 Stunden lang behandelt und dann 72 Stunden lang in Wachstumsmedien gezüchtet wurden. a und b zeigen die Wachstumskurve der Quercetin- und Azithromycin-Entzugsbehandlung. Die Daten werden als Mittelwert (ausgefüllte Kreise) von drei unabhängigen Experimenten dargestellt, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden, mit dem Standardfehler des Mittelwerts (Whisker).

Es ist auch bekannt, dass AZ über den Apikoplasten eine Wirkung auf ein sekundäres Ziel von Parasiten hat [45, 46]. Insbesondere wurde berichtet, dass AZ den Lipidspiegel und die Lipidflüssigkeit der Membran in Zellen beeinflusst [47, 48]. Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse und früheren Daten darauf hin, dass AZ die Sphingolipid- und Phospholipidproduktion im Apikoplasten beeinflussen könnte, die für den Lysezyklus des Parasiten von entscheidender Bedeutung ist.

QUE verursacht eine hohe ROS-Produktion und eine Störung der Mitochondrienmembran, was die Lipidsynthese (z. B. Phospholipide und Sphingolipide) direkt oder indirekt im Apikoplasten und den Mitochondrien beeinträchtigen kann. Lipide sind entscheidend für die Invasion, Proliferation und Modulation von intrazellulärem Kalzium durch T. gondii, das den Austritt von Parasiten auslöst und die meisten Aktivitäten des Lysezyklus im T. gondii-Parasiten steuert. Diese Vermutung bedarf jedoch weiterer Untersuchungen.

Unsere Beobachtung der Wirkung von AZ, die auch nach Absetzen des Arzneimittels aktiv gegen das Wachstum von Tachyzoiten bleibt, bestätigte seine langwirksame Fähigkeit aufgrund seiner hohen Halbwertszeit von > 50 Stunden in Wirtszellen [49].

Die Mitochondrien gelten als Kraftwerk eukaryontischer Zellen und erfüllen verschiedene Funktionen, darunter die Vermittlung von ROS, die ATP-Produktion, die Fettsäuresynthese, die Translation und die Transkription [50]. Um den Wirkungsmechanismus von QUE auf ΔΨm, ATP-Produktion und ROS-Produktion besser zu verstehen, verwendeten wir Tests, die die intrazellulären Parasitenreaktionen auf QUE dosisabhängig maßen. Die Ergebnisse zeigten die Wirkung von QUE auf ΔΨm (siehe Abb. 4a). In ähnlicher Weise beobachteten wir, dass QUE den extrazellulären Parasiten ΔΨm störte (Abb. 4b). Um die Wirkung von QUE auf die ATP-Produktion des Parasiten in vitro zu untersuchen, führten wir außerdem einen ATP-Produktionstest durch (siehe Ergebnisse des Tests in Abb. 5). Es wurde auch eine Untersuchung der ROS-Erzeugung durchgeführt, um die Wirkung von QUE auf die freigesetzten ROS zu bestimmen (siehe Testergebnisse in Abb. 6). Wir beobachteten leichte statistische Unterschiede zwischen 25 µM QUE gegenüber 50 µM H2O2 (p < 0,026) und 12,5 µM QUE gegenüber 50 µM H2O2 (p < 0,026) und bestätigten damit die Ergebnisse einer früheren Studie an Leishmania amazonensis, die zeigte, dass QUE verursacht die Produktion von ROS und eine mitochondriale Dysfunktion [50]. Mehrere Studien haben außerdem gezeigt, dass Verbindungen, die zu einer Störung von ΔΨm und einer hohen ROS-Produktion führen, zu einer Störung der ATP-Produktion bei Parasiten führen können [30, 37, 39, 51]. Darüber hinaus führen Verbindungen, die eine hohe ROS-Produktion und eine Depolarisation der Mitochondrienmembran bewirken, zur Peroxidation langkettiger Fettsäuren und zur Produktion toxischer Zwischenprodukte wie Hexanal, Aldehyd und Alkene in Wirts- und Parasitenzellen, was weiter zu apoptotischen Aktivitäten und schließlich zum Zelltod führt [ 52, 53]. Wir beobachteten einen statistischen Unterschied zwischen den Behandlungen mit QUE, H2O2 (Positivkontrolle) und Medium allein (Negativkontrolle). Unsere aktuelle Studie bestätigte die Ergebnisse früherer Studien zu Lesihmania spp. unter Verwendung von QUE und zeigte einen statistischen Unterschied zwischen der Standard-Positivkontrolle (50 µM H2O2) und 0,62 µM QUE (p < 0,001), 16,67 µM QUE und 0,62 µM QUE (S < 0,001), mittel versus 50 µM H2O2 und 16,67 µM QUE versus 0,62 µM QUE (p < 0,001). Interessanterweise wurde beobachtet, dass die IC50 von QUE allein und in Kombination mit AZ bei submikrolaren Konzentrationen wirksam ist, was im Gegensatz zu den für Leishmania spp. berichteten Ergebnissen steht. [50]. Dieser Unterschied könnte auf die Wirtszelltypen zurückgeführt werden, die als Medium zur Vermehrung der Parasiten verwendet werden, auf die Konzentration von QUE und/oder auf die Anzahl der verwendeten Parasiten. Es wurde auch berichtet, dass QUE stark entzündungshemmend und antioxidativ ist, und diese Eigenschaften wurden mit seiner Oxidations-, Kinase- und Zellzyklushemmung in Verbindung gebracht [54]. Studien haben auch gezeigt, dass es in Krebszellen Apoptose auslösen kann [55]. Unsere früheren Arbeiten mit Dihydroquercetin zeigten eine Hemmung durch T. gondii, jedoch nicht so wirksam wie QUE [32], was möglicherweise teilweise auf die Anzahl der in QUE und dem Analogon Dihydroquercetin verfügbaren Hydroxylgruppen zurückzuführen ist.

a Quercetin stört das Mitochondrienmembranpotential (MMP) in extrazellulären T. gondii-Tachyzoiten. Weiße Pfeile weisen auf Parasiten hin. Das Feld mit Rot stellt das unverfälschte MMP in Parasiten dar und das Feld mit Grün zeigt das beeinträchtigte MMP in Parasiten an, die mit Que (0,62 und 16,67 µM) und einer Standardverbindung (CCCP) bei 50 µM behandelt wurden. Das Grün zeigt einen kompromittierten MMP an. Maßstabsleiste: 200 µm. b Que stört das MMP in intrazellulären T. gondii-Tachyzoiten. Kleine weiße Pfeile weisen auf Parasiten hin, kurze große Pfeilspitzen auf Wirtszellen. Die roten Spitzen zeigen intakte Mitochondrien in Tachyzoiten an, die mit Que (0,62 und 16,67 µM) und einer Standardverbindung CCCP bei 50 µM behandelt wurden. Das Grün zeigt das kompromittierte MMP an. Maßstabsleiste: 200 µm. CCCP, Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon; Que, Quercetin

Quercetin stört die ATP-Produktion in extrazellulären T. gondii-Tachyzoiten. QUE, Quercetin. ** und *** zeigen einen statistischen Unterschied zwischen den Behandlungen bei p < 0,01 bzw. p < 0,001 an

Quercetin induziert die ROS-Produktion in intrazellulären T. gondii-Tachyzoiten. H2O2, Wasserstoffperoxid; QUE, Quercetin; ROS, reaktive Sauerstoffspezies. * zeigt p < 0,05 an

Zusammenfassend stellten wir fest, dass QUE das Tachyzoitenwachstum hemmte und auch eine Störung des Mitochondrienmembranpotentials, einen ATP-Abbau und eine erhöhte ROS-Produktion verursachte. Je nach den mitochondriengesteuerten Signalwegen kann sich jede Organellenstörung direkt oder indirekt auf die Energie und viele andere Signalwege auswirken. Im Vergleich dazu war die Kombinationstherapie (AZ + QUE) im Verhältnis 2:1 (QUE: AZ) wirksamer gegen die Parasitenvermehrung als jede der einzelnen Verbindungen allein. Dies impliziert, dass QUE ein guter Kandidat für eine zukünftige Kombination mit AZ sein könnte. In-vivo-Tests zur Feststellung der Wirksamkeit und Sicherheit werden eine spannende und notwendige Untersuchung sein.

Alle Daten wurden in das Manuskript aufgenommen und Rohdaten sind auf Anfrage erhältlich.

Azithromycin

Halbmaximale Hemmkonzentration

Quercetin

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Referenzen herunterladen

Die folgenden Reagenzien wurden über das NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository, NAID, NIH und BEI Resources erhalten: Vero-Nierenzellen (Afrikanische Grüne Meerkatze), die Luciferase (Luc2p) exprimieren; NR-10385 MDCK-Nierenzellen. Die RH-(YFP)2-Zelllinie wurde freundlicherweise von Prof. William H. Witola vom College of Veterinary Medicine der University of Illinois, Urbana-Champaign, IL, USA, zur Verfügung gestellt. Wir danken Bernard BA Efa für den Transport der Platten für die Mikroskopiearbeiten.

Es wurden keine externen Mittel bereitgestellt. Die Arbeit wurde von der Alabama State University durch das Department of Biological Sciences im Rahmen des PhD-Programms der Abteilung Mikrobiologie unterstützt.

Department of Biological Sciences, College of Science, Technology, Engineering and Mathematics, Alabama State University, Montgomery, AL, 36104, USA

Daniel A. Abugri, Sandani VT Wijerathne, Homa Nath Sharma, Joseph A. Ayariga, Audrey Napier und Boakai K. Robertson

Mikrobiologie-Doktorandenprogramm, Department of Biological Sciences, College of Science, Technology, Engineering and Mathematics, Alabama State University, Montgomery, AL, 36104, USA

Daniel A. Abugri, Sandani VT Wijerathne, Homa Nath Sharma und Boakai K. Robertson

Labor für Ethnomedizin, Parasitologie und Arzneimittelforschung, Hochschule für Wissenschaft, Technologie, Ingenieurwesen und Mathematik, Alabama State University, Montgomery, AL, 36104, USA

Daniel A. Abugri & Homa Nath Sharma

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DAA hat die Informationen konzipiert. SW, JAA, HNS und DAA führten die Experimente durch. JAA, HNS und DAA führten die Statistiken durch. DAA hat den ersten Aufsatz verfasst. JAA, AN und BKR steuerten technische Ratschläge und Ressourcen bei, machten Vorschläge für die experimentellen Ansätze und lasen die Manuskripte durch, um Korrekturen vorzunehmen.

Korrespondenz mit Daniel A. Abugri.

An der Studie sind keine Wirbeltiere beteiligt.

Alle Autoren waren sich über den Inhalt des zu veröffentlichenden Artikels einig.

Es besteht kein konkurrierendes Interesse.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Abugri, DA, Wijerathne, SVT, Sharma, HN et al. Quercetin hemmt die Proliferation von Toxoplasma gondii-Tachyzoiten und wirkt synergistisch mit Azithromycin. Parasites Vectors 16, 261 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05849-3

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Eingegangen: 09. Februar 2023

Angenommen: 26. Juni 2023

Veröffentlicht: 03. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05849-3

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